本文關(guān)鍵詞：茄科青枯菌致病力喪失相關(guān)基因的功能研究

  更多相關(guān)文章： 茄科青枯菌 自然致病力喪失 致病力相關(guān)基因 二代重測(cè)序 基因組測(cè)序 同源重組

【摘要】：茄科青枯菌(Ralstonia solanacearum)是世界上最重要的植物病原細(xì)菌之一,寄主范圍廣泛,可侵染50科450余種寄主植物。該病原菌在保存過(guò)程中易發(fā)生自然突變喪失致病力,但其機(jī)理還不清楚。本論文以分離自沙姜的茄科青枯菌自然致病力喪失突變體YC40-M作為研究對(duì)象,測(cè)定了突變體基因組全序列、篩選出突變基因、分析了5個(gè)致病相關(guān)候選基因功能,旨在揭示茄科青枯菌自然致病力喪失的分子機(jī)理,為青枯病防控技術(shù)研究提供理論依據(jù)。主要研究結(jié)果如下:1.以茄科青枯菌GMI1000基因組作為參考,對(duì)沙姜青枯菌株YC40的自然致病力喪失突變菌株YC40-M及其野生型YC40-W進(jìn)行基因組重測(cè)序分析,SNP位點(diǎn)統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示,YC40-M有45745個(gè)SNP位點(diǎn),其中同義突變19443個(gè),非同義突變18006個(gè);YC40-W有45745位點(diǎn),其中同義突變19689個(gè),非同義突變18039個(gè)。InDel位點(diǎn)統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明,YC40-M有1312個(gè)InDel位點(diǎn),其中移碼突變基因323個(gè),非移碼突變基因210個(gè);而YC40-W有1291個(gè)InDel位點(diǎn),其中移碼突變基因314個(gè),非移碼突變基因208個(gè)。YC40-M與YC40-W差異位點(diǎn)1518個(gè),非同義突變基因102個(gè),包括堿基置換突變基因67個(gè),移碼突變基因35個(gè)。2.應(yīng)用二代高通量Illumina Miseq和第三代PacBio測(cè)序技術(shù),對(duì)YC40-M基因組全序列進(jìn)行測(cè)定,其基因組全長(zhǎng)為5.75Mb,包含5399個(gè)基因,4個(gè)rRNA操縱子,57個(gè)tRNA,其中染色體大小為3,844,764 bp(GenBank no.CP015850),編碼3716個(gè)基因;宏質(zhì)粒大小為1,907,366 bp(GenBank no.CP015851),編碼1683個(gè)基因。染色體的基因中有3081個(gè)可以歸屬于COG家族,宏質(zhì)�；蛑杏�770個(gè)可以歸屬于COG家族,還有224個(gè)基因在數(shù)據(jù)庫(kù)中沒(méi)有任何匹配。3.基因敲除構(gòu)建YC40-W PhcA基因突變體YC40ΔPhcA。生物學(xué)測(cè)定顯示,YC40ΔPhcA表型發(fā)生轉(zhuǎn)換,生物膜增多,運(yùn)動(dòng)性增強(qiáng),生長(zhǎng)速率降低,生長(zhǎng)增殖穩(wěn)定期延長(zhǎng),對(duì)沙姜、番茄和辣椒的致病力較野生型菌株明顯下降,驗(yàn)證了PhcA基因是參與青枯菌表型轉(zhuǎn)換的關(guān)鍵基因。自然突變株YC40-M與YC40ΔPhc A相比,無(wú)致病力、無(wú)運(yùn)動(dòng)性、不引起煙草HR反應(yīng)及在Boucher培養(yǎng)基中基本不生長(zhǎng)。因此,Phc A參與青枯菌致病,而YC40-M與YC40ΔPhcA存在差異,說(shuō)明青枯菌的自然致病力喪失除PhcA基因外還有其他基因參與。4.ParA2基因是細(xì)胞過(guò)程一種編碼基因,ParA2基因敲除與功能分析表明,YC40-W ParA2基因突變體菌落明顯變小,生長(zhǎng)緩慢,胞外多糖分泌顯著減少,無(wú)流動(dòng)性,生物膜形成量減少,在NA培養(yǎng)基和Boucher基礎(chǔ)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)速率均降低;突變體對(duì)沙姜的致病力明顯降低。因此,ParA2基因?qū)η嗫菥纳L(zhǎng)、胞外多糖分泌及其致病有重要作用。5.將YC40-W的RSp801、RSp931和RSc2202基因分別替換為YC40-M相應(yīng)的突變基因片段,分別構(gòu)建3個(gè)基因的突變體,其中RSp801基因突變體胞外多糖分泌增加,流動(dòng)性增大,菌落直徑變大,生物膜減少,在Boucher基礎(chǔ)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)速率降低;RSp931基因突變體表型無(wú)明顯變化,生物膜產(chǎn)量減少,在Boucher基礎(chǔ)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)速率降低;RSc2202基因突變體胞外多糖分泌減少,流動(dòng)性減弱,菌落直徑變小,生物膜產(chǎn)量顯著降低,在Boucher基礎(chǔ)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)速率降低。接種寄主沙姜結(jié)果表明,RSc2202基因突變體接種處理的病株率比YC40-W低50%,說(shuō)明其致病力下降;RSp801和RSp931基因突變體接種處理的病株率與YC40-W相同,但前者病情發(fā)展加快,后者病情減緩,說(shuō)明前者致病力較野生型增強(qiáng),而后者致病力下降。因此,RSp801、RSp931和RSc2202基因與青枯菌的致病力相關(guān)。
【關(guān)鍵詞】：茄科青枯菌 自然致病力喪失 致病力相關(guān)基因 二代重測(cè)序 基因組測(cè)序 同源重組
【學(xué)位授予單位】：華南農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：S432.42
【目錄】：

• 摘要3-5
• Abstract5-15
• 1 前言15-33
• 1.1 茄科青枯菌分布及其危害15-16
• 1.1.1 茄科青枯菌分布15
• 1.1.2 茄科青枯菌危害15-16
• 1.2 茄科青枯菌特性16-21
• 1.2.1 茄科青枯菌侵染特性16-18
• 1.2.2 植物發(fā)病癥狀18
• 1.2.3 病原菌傳統(tǒng)分類(lèi)及演化型分類(lèi)框架18-21
• 1.3 青枯菌致病相關(guān)因子21-26
• 1.3.1 Ⅲ型分泌系統(tǒng)及其效應(yīng)子21-24
• 1.3.2 胞外多糖24
• 1.3.3 細(xì)胞壁降解酶(CWDE)相關(guān)基因24
• 1.3.4 運(yùn)動(dòng)性24-25
• 1.3.5 青枯菌解毒基因25-26
• 1.4 青枯菌群體感應(yīng)下的表型轉(zhuǎn)化26-30
• 1.4.1 群體感應(yīng)機(jī)制26-27
• 1.4.2 青枯菌表型轉(zhuǎn)化27-30
• 1.5 青枯菌基因組學(xué)30-32
• 1.5.1 青枯菌的基因組基本特征30
• 1.5.2 青枯菌全基因組30-32
• 1.5.3 基因水平轉(zhuǎn)移與前噬菌體的作用32
• 1.6 沙姜青枯病菌32-33
• 1.7 本研究的目的及意義33
• 2 材料與方法33-52
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料33-38
• 2.1.1 菌株、質(zhì)粒、引物及寄主植物33-35
• 2.1.2 試劑、培養(yǎng)基和緩沖液35-38
• 2.2 主要儀器38-39
• 2.3 青枯菌菌株YC40-W、YC40-M重測(cè)序分析39-40
• 2.4 青枯菌YC40-M基因組測(cè)序40-42
• 2.4.1 基因組DNA提取40
• 2.4.2 基因組序列測(cè)定及分析40-42
• 2.5 自殺質(zhì)粒構(gòu)建42-47
• 2.5.1 PhcA基因自殺質(zhì)粒構(gòu)建42-45
• 2.5.2 ParA2基因自殺質(zhì)粒構(gòu)建45
• 2.5.3 RSp801、RSp931、RSc2202基因自殺質(zhì)粒構(gòu)建45-47
• 2.6 青枯菌YC40感受態(tài)細(xì)胞的制備及電擊轉(zhuǎn)化47
• 2.7 突變體篩選及鑒定47-49
• 2.7.1 PhcA基因突變體篩選及鑒定47-48
• 2.7.2 ParA2基因突變體篩選及鑒定48
• 2.7.3 RSp801、RSp931、RSc2202基因突變菌株的篩選及鑒定48-49
• 2.8 基因功能互補(bǔ)菌株的篩選和鑒定49
• 2.8.1 PhcA基因功能互補(bǔ)菌株的的篩選和鑒定49
• 2.8.2 ParA2基因功能互補(bǔ)菌株的的篩選和鑒定49
• 2.8.3 RSp801、RSp931、RSc2202基因功能互補(bǔ)菌株的的篩選和鑒定49
• 2.9 基因的功能分析49-52
• 2.9.1 PhcA基因功能分析49-52
• 2.9.2 ParA2基因功能分析52
• 2.9.3 RSp801、RSp931、RSc2202基因功能分析52
• 3 結(jié)果與分析52-92
• 3.1 青枯菌YC40-W、YC40-M重測(cè)序結(jié)果52-54
• 3.2 青枯菌YC40-M基因組測(cè)序結(jié)果54-61
• 3.2.1 原始測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)控54-55
• 3.2.2 測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)55-56
• 3.2.3 基因組組裝56
• 3.2.4 基因預(yù)測(cè)結(jié)果56-57
• 3.2.5 基因注釋57-60
• 3.2.6 基因組特征60-61
• 3.3 PhcA基因功能分析61-72
• 3.3.1 青枯菌YC40 PhcA突變體的構(gòu)建和驗(yàn)證61-63
• 3.3.2 YC40ΔPhcA菌株表型特征63-64
• 3.3.3 YC40 PhcA基因缺失突變體功能互補(bǔ)64-65
• 3.3.4 YC40ΔPhcA與YC40-M生物學(xué)測(cè)定65-69
• 3.3.5 YC40ΔPhcA、YC40-M致病性測(cè)定結(jié)果69
• 3.3.6 YC40ΔPhcA及YC40-W菌株寄主范圍測(cè)定結(jié)果69-72
• 3.4 Par A2基因功能分析72-77
• 3.4.1 青枯菌YC40菌株P(guān)arA2突變體的構(gòu)建結(jié)果72
• 3.4.2 YC40 ParA2基因缺失突變體功能互補(bǔ)72-73
• 3.4.3 ParA2突變體生物學(xué)試驗(yàn)結(jié)果73-76
• 3.4.4 突變體對(duì)沙姜的致病性分析結(jié)果76-77
• 3.5 基因RSp801、RSp931和RSc2202的功能分析77-92
• 3.5.1 基因生物信息學(xué)分析結(jié)果77-78
• 3.5.2 RSp801、RSp931、RSc2202基因自殺質(zhì)粒和突變菌株篩選驗(yàn)證78-79
• 3.5.3 3個(gè)基因突變體功能互補(bǔ)79
• 3.5.4 YC40Δ801 突變體生物學(xué)特性79-82
• 3.5.5 YC40Δ801 突變體對(duì)沙姜的致病性分析82-83
• 3.5.6 YC40Δ931 突變體生物學(xué)特性83-86
• 3.5.7 YC40Δ931 突變體對(duì)沙姜的致病性分析86-87
• 3.5.8 YC40Δ2202 突變體生物學(xué)特性87-90
• 3.5.9 YC40Δ2202 突變體對(duì)沙姜的致病性分析90-92
• 4 結(jié)論與討論92-99
• 4.1 重測(cè)序分析青枯菌YC40自然致病力喪失突變體及其野生型全基因組92-93
• 4.2 青枯菌YC40自然致病力喪失突變體基因組序列特征93-95
• 4.3 青枯菌Phc A基因的功能95-97
• 4.4 YC40菌株自然致病力喪失突變體與PhcA基因缺失突變體的差異97
• 4.5 YC40菌株P(guān)ar A2基因的功能97-98
• 4.6 YC40菌株RSp801、RSp931和RSc2202基因的功能98-99
• 4.7 5個(gè)基因的互補(bǔ)試驗(yàn)99
• 5 總結(jié)論與未來(lái)研究建議99-101
• 5.1 總結(jié)論99-100
• 5.2 未來(lái)研究建議100-101
• 致謝101-103
• 參考文獻(xiàn)103-113

【參考文獻(xiàn)】

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