本文關(guān)鍵詞：家蠶微孢子蟲(chóng)Met-AP2基因驗(yàn)證與煙曲霉素治療效果檢測(cè)

  更多相關(guān)文章： 家蠶微孢子蟲(chóng) Met-AP2基因 基因驗(yàn)證 煙曲霉素 LAMP 治療效果

【摘要】：微孢子蟲(chóng)可以感染幾乎所有動(dòng)物,包括大多數(shù)的昆蟲(chóng),微孢子蟲(chóng)和微孢子蟲(chóng)病的研究一直是病理學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。家蠶微孢子蟲(chóng)病既可以通過(guò)水平傳播,也可以經(jīng)胚胎傳播,威脅著各養(yǎng)蠶國(guó)家的蠶桑產(chǎn)業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展,因此家蠶微孢子蟲(chóng)病是蠶業(yè)生產(chǎn)上最重要的檢疫防控對(duì)象。自從在人腸道微孢子蟲(chóng)病治療研究中發(fā)現(xiàn)煙曲霉素及其衍生物、類(lèi)似物均具有明顯的治療效果,且作用的靶位點(diǎn)是Met-AP2基因,這為家蠶微孢子蟲(chóng)病的治療機(jī)理研究提供了方向。故本課題擬在家蠶微孢子蟲(chóng)基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選尋找家蠶微孢子蟲(chóng)Met-AP2基因的存在基礎(chǔ)上,嘗試應(yīng)用對(duì)人微孢子蟲(chóng)病治療有效的藥物煙曲霉素對(duì)家蠶微孢子蟲(chóng)病進(jìn)行模擬治療研究,探討藥物處理前后在人工感染家蠶微孢子蟲(chóng)的家蠶組織中微孢子蟲(chóng)Met-AP2基因的變化規(guī)律,以期為家蠶微孢子蟲(chóng)病的治療提供實(shí)驗(yàn)參考和理論依據(jù)。本論文在課題組前期開(kāi)展家蠶微孢子蟲(chóng)基因組和轉(zhuǎn)錄組(廣東株)研究基礎(chǔ)上,通過(guò)生物信息學(xué)方法篩選出與煙曲霉素藥物治療相關(guān)靶基因Met-AP2進(jìn)行了PCR測(cè)序驗(yàn)證及檢測(cè)應(yīng)用研究,并對(duì)其基因功能及其在家蠶組織中的不同侵染階段的表達(dá)功能等進(jìn)行了分析研究,旨在為家蠶微孢子蟲(chóng)病有效治療提供分子依據(jù)。結(jié)果如下:(1)家蠶微孢子蟲(chóng)Met-AP2基因的驗(yàn)證及生物信息學(xué)分析在對(duì)家蠶微孢子蟲(chóng)的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中推斷的Met-AP2基因進(jìn)行PCR克隆測(cè)序驗(yàn)證,經(jīng)不同引物測(cè)序驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)相似性都在93%以上,其中MC-F/R引物測(cè)序結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)相似性高達(dá)99.9%;以引物MC-F/R,2047F/R對(duì)其他家蠶常見(jiàn)病原微生物及4種昆蟲(chóng)微孢子蟲(chóng)中Met-AP2基因的特異性,敏感性進(jìn)行PCR鑒別,并以引物MC-F/R對(duì)相應(yīng)片段進(jìn)行克隆測(cè)序分析。發(fā)現(xiàn)家蠶微孢子蟲(chóng)(廣東株)只存在一個(gè)Met-AP2基因,開(kāi)放閱讀框1077 bp,共編碼358個(gè)氨基酸,其編碼蛋白的分子量約為45kDa,為疏水的穩(wěn)定蛋白。Met-AP2基因序列上沒(méi)有預(yù)測(cè)的信號(hào)肽糖基化位點(diǎn)及跨膜結(jié)構(gòu)域,其蛋白結(jié)構(gòu)中存在典型的α helix元件。(2)建立了原核重組質(zhì)粒pET-28a met使用pET-28a載體,Rosetta感受態(tài)細(xì)胞,對(duì)Met-AP2進(jìn)行原核表達(dá),并通過(guò)SDS-PAGE和Western blot驗(yàn)證其分子量為45KDa,與預(yù)測(cè)結(jié)果相符。對(duì)融合蛋白進(jìn)行鎳瓊脂糖親和層析純化后得到純度較高的蛋白。(3)家蠶微孢子蟲(chóng)煙曲霉素治療效果驗(yàn)證及Met-AP2靶基因應(yīng)用對(duì)正常家蠶、感病家蠶、只添食藥物煙曲霉素家蠶和感病后煙曲霉素治療的家蠶進(jìn)行了比較觀察,發(fā)現(xiàn)添食藥物之后的家蠶表面無(wú)明顯的病斑。同時(shí)篩選了5對(duì)以Met-AP2基因?yàn)榘谢虻腖AMP引物,選了其中一個(gè)效果較好的引物L(fēng)M1,優(yōu)化了合適的內(nèi)外引物配比和擴(kuò)增溫度,創(chuàng)新地建立一套基于Met-AP2基因的家蠶微孢子蟲(chóng)LAMP檢測(cè)方法。同時(shí)通過(guò)對(duì)添食藥物前后不同時(shí)期中腸組織的進(jìn)行了LAMP檢測(cè),從分子水平上驗(yàn)證了煙曲霉素治療家蠶微孢子蟲(chóng)病的效果,為生產(chǎn)上推進(jìn)應(yīng)用煙曲霉素藥物治療家蠶微孢子蟲(chóng)病提供實(shí)驗(yàn)參考。
【關(guān)鍵詞】：家蠶微孢子蟲(chóng) Met-AP2基因 基因驗(yàn)證 煙曲霉素 LAMP 治療效果
【學(xué)位授予單位】：華南農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：S884
【目錄】：

• 摘要3-5
• Abstract5-7
• 論文縮寫(xiě)詞中英文對(duì)照7-11
• 1.前言11-28
• 1.1 微孢子蟲(chóng)概述11-15
• 1.1.1 微孢子蟲(chóng)結(jié)構(gòu)11-12
• 1.1.2 微孢子蟲(chóng)基因組學(xué)研究進(jìn)展12-15
• 1.2 家蠶微孢子蟲(chóng)病的發(fā)病及流行15-16
• 1.2.1 家蠶微孢子蟲(chóng)發(fā)病及癥狀15-16
• 1.2.2 家蠶微孢子蟲(chóng)病的流行16
• 1.3 微孢子蟲(chóng)病的診斷16-18
• 1.3.1 微孢子蟲(chóng)病病原染色鑒別16-17
• 1.3.2 微孢子蟲(chóng)病的免疫學(xué)方法診斷17
• 1.3.3 微孢子蟲(chóng)病的分子生物學(xué)方法診斷17
• 1.3.4 微孢子蟲(chóng)病的LAMP方法診斷17-18
• 1.4 微孢子蟲(chóng)的治療18-21
• 1.4.1 微孢子蟲(chóng)的物理治療18-19
• 1.4.2 微孢子蟲(chóng)的化學(xué)治療19-21
• 1.5 煙曲霉素21-22
• 1.5.1 煙曲霉素的發(fā)現(xiàn)及結(jié)構(gòu)21
• 1.5.2 煙曲霉素的用途及治療作用進(jìn)展21-22
• 1.6 Met-AP2基因的研究概述22-25
• 1.6.1 Met-AP的發(fā)現(xiàn)22
• 1.6.2 Met-AP的簡(jiǎn)介22-23
• 1.6.3 Met-AP2的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)23-24
• 1.6.4 Met-AP2的功能及進(jìn)展24-25
• 1.7 煙曲霉素抑制Met-AP2的作用機(jī)理25-26
• 1.8 本論文研究意義及內(nèi)容26-28
• 2. 材料與方法28-44
• 2.1 材料28-31
• 2.1.1 生物材料28-29
• 2.1.2 主要試劑及藥品29-30
• 2.1.3 主要儀器30
• 2.1.4 軟件及相關(guān)在線預(yù)測(cè)網(wǎng)站30-31
• 2.2 方法31-44
• 2.2.1 生物材料的分離、純化、核酸提取31-33
• 2.2.2 家蠶微孢子蟲(chóng)Met-AP2基因注釋和功能預(yù)測(cè)33-34
• 2.2.3 家蠶微孢子蟲(chóng)Met-AP2基因引物的設(shè)計(jì)34
• 2.2.4 不同昆蟲(chóng)微孢子蟲(chóng)Met-AP2基因的PCR擴(kuò)增34-35
• 2.2.5 微孢子蟲(chóng)Met-AP2基因克隆重組質(zhì)粒的構(gòu)建及測(cè)序分析35-36
• 2.2.6 家蠶微孢子蟲(chóng)Met-AP2基因系統(tǒng)發(fā)育分析36
• 2.2.7 家蠶微孢子蟲(chóng)Met-AP2基因原核表達(dá)36-40
• 2.2.8 家蠶微孢子蟲(chóng)Met-AP2基因LAMP方法建立40-44
• 3 結(jié)果與分析44-78
• 3.1 煙曲霉素對(duì)家蠶微孢子蟲(chóng)病治療結(jié)果44-48
• 3.1.1 煙曲霉素對(duì)家蠶微孢子蟲(chóng)病治療表征觀察結(jié)果44-46
• 3.1.2 煙曲霉素對(duì)家蠶微孢子蟲(chóng)病治療治愈率及對(duì)家蠶影響的結(jié)果46-48
• 3.2 家蠶微孢子蟲(chóng)（廣東株）轉(zhuǎn)錄組的Met-AP2基因測(cè)序結(jié)果的PCR驗(yàn)證48-57
• 3.2.1 家蠶微孢子蟲(chóng)Met-AP2基因引物篩選驗(yàn)證48-55
• 3.2.2 家蠶微孢子蟲(chóng)（廣東株）轉(zhuǎn)錄組的Met-AP2基因測(cè)序結(jié)果驗(yàn)證55-56
• 3.2.3 煙曲霉素對(duì)家蠶微孢子蟲(chóng)病治療前后PCR擴(kuò)增結(jié)果56-57
• 3.3 家蠶微孢子蟲(chóng)Met-AP2基因的生物信息學(xué)及分析57-63
• 3.3.1 家蠶微孢子蟲(chóng)Met-AP2蛋白的結(jié)構(gòu)分析57-59
• 3.3.2 家蠶微孢子蟲(chóng)Met-AP2基因與其他物種Met-AP2基因相似性及進(jìn)化樹(shù)分析59-63
• 3.4 家蠶微孢子蟲(chóng)Met-AP2蛋白的原核表達(dá)63-68
• 3.4.1 大腸桿菌克隆載體的構(gòu)建和鑒定63-64
• 3.4.2 大腸桿菌重組表達(dá)載體pET-28A met的構(gòu)建和鑒定64-65
• 3.4.3 融合蛋白誘導(dǎo)結(jié)果65-66
• 3.4.4 融合蛋白的鎳瓊脂糖親和層析純化66-67
• 3.4.5 融合蛋白的鑒定及濃度測(cè)定67-68
• 3.5 基于Met-AP2靶基因的LAMP方法在煙曲霉素治療效果檢測(cè)上的應(yīng)用68-78
• 3.5.1 基于Met-AP2靶基因的LAMP引物的篩選結(jié)果68-70
• 3.5.2 基于Met-AP2靶基因的LM1引物組反應(yīng)條件的優(yōu)化70-72
• 3.5.3 基于Met-AP2靶基因的LM1引物組的特異性及靈敏度檢測(cè)72-77
• 3.5.4 基于Met-AP2靶基因的LM1引物組的煙曲霉素治療效果的檢測(cè)77-78
• 4 討論與結(jié)論78-86
• 4.1 討論78-85
• 4.1.1 家蠶微孢子蟲(chóng)病的癥狀及煙曲霉素治療情況研究78-79
• 4.1.2 家蠶微孢子蟲(chóng)Met-AP2基因研究79-83
• 4.1.3 家蠶微孢子蟲(chóng)Met-AP2蛋白研究83-84
• 4.1.4 家蠶微孢子蟲(chóng)病治療效果LAMP檢測(cè)研究84-85
• 4.1.5 后續(xù)工作85
• 4.2 結(jié)論85-86
• 致謝86-87
• 參考文獻(xiàn)87-99
• 附錄A99-107
• 附錄B107-109
• 攻讀學(xué)位期間的學(xué)術(shù)成果109

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：674380