本文關(guān)鍵詞：肺臟特異性表達(dá)Cre重組酶轉(zhuǎn)基因小型豬的建立，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

《吉林大學(xué)》 2014年

肺臟特異性表達(dá)Cre重組酶轉(zhuǎn)基因小型豬的建立

雒偉偉  

【摘要】：利用Cre/loxP系統(tǒng)制備條件性基因敲除小鼠動(dòng)物模型是活體內(nèi)研究基因功能的有效策略。然而，在某些方面，小鼠、大鼠等嚙齒類動(dòng)物并不適合于人類疾病模型。豬作為哺乳動(dòng)物，在基因組水平、器官結(jié)構(gòu)大小、生理特征等方面都與人類更接近。因此，人類疾病的豬動(dòng)物模型能夠更好地反應(yīng)疾病的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程和病理特征。在本實(shí)驗(yàn)中，利用豬體細(xì)胞核移植技術(shù)（somatic cell nuclear transfer,SCNT）構(gòu)建組織特異性表達(dá)Cre重組酶轉(zhuǎn)基因小型豬，為進(jìn)行組織特異性基因敲除小型豬動(dòng)物模型構(gòu)建提供Cre重組酶表達(dá)工具豬。 為了獲得腎臟特異性表達(dá)Cre重組酶的轉(zhuǎn)基因小型豬，我們選擇豬源AQP2基因啟動(dòng)子區(qū)序列來(lái)驅(qū)動(dòng)Cre重組酶表達(dá)。AQP2(Aquaporin2)屬于水通道蛋白家族，主要表達(dá)于哺乳動(dòng)物腎臟集合管細(xì)胞�；谛⌒拓i體內(nèi)AQP2表達(dá)分析結(jié)果與AQP2基因啟動(dòng)子區(qū)序列多重比對(duì)分析結(jié)果，選擇豬源AQP2轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游3,090bp序列來(lái)驅(qū)動(dòng)Cre重組酶表達(dá)。構(gòu)建的Cre表達(dá)載體命名為AQP2-Cre，全長(zhǎng)11,045bp。載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染五種細(xì)胞系：PK15、Hela、A549、HepG-2、LLC-PK1，并分析Cre重組酶表達(dá)情況。檢測(cè)結(jié)果表明，AQP2-Cre在LLC-PK1細(xì)胞中表達(dá)，其它細(xì)胞系中不表達(dá)。 AQP2-Cre載體線性化后，轉(zhuǎn)染中國(guó)實(shí)驗(yàn)小型豬胎兒成纖維細(xì)胞。利用含G418(450μg/ml)的選擇性DMEM培養(yǎng)基篩選14天左右，獲得具有neo抗性的細(xì)胞克隆。提取細(xì)胞克隆基因組DNA，利用跨Cre表達(dá)序列與AQP2基因啟動(dòng)子區(qū)序列的跨區(qū)檢測(cè)引物進(jìn)行PCR鑒定，并測(cè)序鑒定。選取三株細(xì)胞狀態(tài)良好的陽(yáng)性AQP2-Cre轉(zhuǎn)基因細(xì)胞克隆作為核供體細(xì)胞，共制備1427枚重構(gòu)胚，分別輸入到5頭待孕母豬輸卵管。結(jié)果，3頭受孕母豬順利分娩，共獲得12頭克隆小型豬（均來(lái)自同一細(xì)胞克隆）。利用AQP2-Cre跨區(qū)檢測(cè)引物鑒定新生克隆小型豬，結(jié)果表明12頭全部為陽(yáng)性。測(cè)序結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因小型豬基因組整合了完整的Cre表達(dá)序列。 利用RT-PCR與western blotting分析轉(zhuǎn)基因小型豬Cre表達(dá)情況。檢測(cè)結(jié)果顯示，Cre重組酶表達(dá)于AQP2-Cre轉(zhuǎn)基因小型豬肺臟組織，其它組織中不表達(dá)。免疫組化分析結(jié)果表明，Cre重組酶表達(dá)于肺泡上皮細(xì)胞，且細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核均有表達(dá)。 利用反向PCR (Inverse PCR)分析外源基因在AQP2-Cre轉(zhuǎn)基因小型豬基因組上的整合位點(diǎn)，利用絕對(duì)定量PCR (Absolutly qRT-PCR)分析各轉(zhuǎn)基因小型豬基因組的Cre拷貝數(shù)。共檢測(cè)到4個(gè)AQP2-Cre整合位點(diǎn)，Cre拷貝數(shù)為8-12。不同轉(zhuǎn)基因小型豬，或同一轉(zhuǎn)基因小型豬各組織基因組樣本中，Cre拷貝數(shù)差異均不明顯（P0.5）。隨后，檢測(cè)了5頭不同月齡(新生、1月齡、5月齡、10月齡、15月齡)轉(zhuǎn)基因小型豬肺組織基因組中AQP2-Cre整合情況，并利用相對(duì)定量PCR (Relative qRT-PCR)分析了Cre重組酶的表達(dá)變化。分析結(jié)果表明，不同月齡AQP2-Cre轉(zhuǎn)基因小型豬，Cre拷貝數(shù)無(wú)明顯變化(P0.5)，且Cre重組酶能夠穩(wěn)定表達(dá)(P0.5)。 為進(jìn)一步分析Cre重組酶在傳代過(guò)程中的表達(dá)變化，我們選擇5月齡轉(zhuǎn)基因小型豬與正常非轉(zhuǎn)基因小型豬雜交，獲得3頭為陽(yáng)性AQP2-Cre轉(zhuǎn)基因小型豬。分析結(jié)果表明F1代陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因小型豬同樣為肺泡上皮細(xì)胞特異性表達(dá)Cre重組酶。AQP2-Cre整合情況分析結(jié)果表明，F(xiàn)1代轉(zhuǎn)基因小型豬基因組樣本中Cre拷貝數(shù)為5-6。相比較于F0代轉(zhuǎn)基因小型豬，Cre拷貝數(shù)明顯減少(P0.05)，且其中一頭轉(zhuǎn)基因小型豬基因組中只檢測(cè)到3個(gè)整合位點(diǎn)。利用相對(duì)定量PCR方法分析轉(zhuǎn)基因小型豬傳代過(guò)程中Cre重組酶表達(dá)水平變化。結(jié)果顯示，，傳代后Cre重組酶表達(dá)量無(wú)明顯變化(P0.05)。 在本實(shí)驗(yàn)中，雖然沒(méi)有明確導(dǎo)致AQP2-Cre轉(zhuǎn)基因豬肺臟特異性表達(dá)Cre重組酶的原因。但分析結(jié)果表明，本實(shí)驗(yàn)所制備AQP2-Cre轉(zhuǎn)基因小型豬能夠穩(wěn)定表達(dá)Cre重組酶。結(jié)合實(shí)驗(yàn)室之前進(jìn)行的Cre重組酶活性研究結(jié)果，認(rèn)為該AQP2-Cre轉(zhuǎn)基因小型豬能夠應(yīng)用于肺臟特異性基因敲除豬模型的構(gòu)建。

【關(guān)鍵詞】：
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：Q789
【目錄】：

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4 楊春;肝特異性表達(dá)Cre重組酶載體和轉(zhuǎn)基因豬成纖維細(xì)胞的構(gòu)建[D];吉林大學(xué);2008年

5 徐瑛;神經(jīng)細(xì)胞特異性Cre重組酶表達(dá)載體的構(gòu)建及其體外表達(dá)研究[D];福建醫(yī)科大學(xué);2008年

6 胥珊;幾種不同NLS對(duì)重組酶刪除效率影響的初步研究[D];西南大學(xué);2009年

7 楊麗華;四環(huán)素誘導(dǎo)的Cre重組酶表達(dá)載體的構(gòu)建及其體外表達(dá)研究[D];福建醫(yī)科大學(xué);2009年

8 吳少璞;功能性穩(wěn)定表達(dá)Cre重組酶的vero-Cre細(xì)胞系的構(gòu)建[D];鄭州大學(xué);2009年

9 陳興啟;基因打靶載體pA2TR的構(gòu)建[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2008年

10 譚虎;HD5與GLP2表達(dá)載體構(gòu)建及其對(duì)放燒傷小鼠腸源性感染的影響[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2004年

  本文關(guān)鍵詞：肺臟特異性表達(dá)Cre重組酶轉(zhuǎn)基因小型豬的建立，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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