本文關(guān)鍵詞：轉(zhuǎn)1Dx5基因致小麥內(nèi)源1Dx2基因沉默因素的探究

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【摘要】：本研究以新疆耐鹽小麥品種新冬26為受體材料,采用花粉管通道轉(zhuǎn)基因法將1Dx5基因轉(zhuǎn)入受體植株,獲得轉(zhuǎn)基因T0代小麥,在對(duì)其T1代種子的檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)有部分種子內(nèi)源1Dx2基因沒(méi)有表達(dá)。為此我們構(gòu)建了3個(gè)大麥條斑花葉病毒(BSMV)重組載體,攜帶外源1Dx5基因上的部分片段去感染含有1Dx2基因的中國(guó)春小麥,以探究外源基因?qū)胧欠窨梢杂捎赗NA干擾的作用引起內(nèi)源基因的沉默。為轉(zhuǎn)基因育種中基因沉默的現(xiàn)象提供理論依據(jù),進(jìn)而加快轉(zhuǎn)基因育種的進(jìn)程。主要研究結(jié)果如下:(1)花粉管通道法轉(zhuǎn)基因條件的優(yōu)化。在花粉管通道法轉(zhuǎn)基因過(guò)程中,控制授粉后到基因轉(zhuǎn)化之間的時(shí)間間隔,以1.0h、2.0h、3.0h、4.0h為處理,證明在處理時(shí)間為2.0h時(shí)基因轉(zhuǎn)化效率最高,達(dá)到2.78%,平均轉(zhuǎn)化率約0.94%,獲得了轉(zhuǎn)優(yōu)質(zhì)HMW-GS 1Dx5基因的轉(zhuǎn)基因小麥。(2)轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性小麥T1代種子的HMW-GS組成分析。最終育成的37個(gè)轉(zhuǎn)基因株系,共收獲4686粒T1代種子,其中隨機(jī)挑選的1/4的種子(共1178粒)SDS-PAGE電泳,在蛋白質(zhì)水平上T1代種子的HMW-GS組成出現(xiàn)3種表型:表型Ⅰ,外源1Dx5基因沒(méi)有表達(dá);表型Ⅱ,外源1Dx5基因表達(dá);表型Ⅲ,內(nèi)源1Dx2基因沒(méi)有表達(dá),這三種表型在不同的株系和不同的單穗中都普遍存在,分別出現(xiàn)的概率約為34.3%,45.9%和19.8%。(3)建立BSMV病毒誘導(dǎo)基因沉默的體系。以八氫番茄紅素脫氫酶基因(PDS)為指示基因,小麥抽穗時(shí),在穗部接種感染BSMV:PDS,同時(shí)以接種BSMV:00為對(duì)照,發(fā)現(xiàn):接種BSMV:PDS的小麥穗在接種的第5-8天出現(xiàn)光漂白性,在第15天現(xiàn)象比較明顯,到接種的第23-25天光漂白現(xiàn)象達(dá)到最大程度,而接種了BSMV:00的對(duì)照組小麥穗?yún)s沒(méi)有該現(xiàn)象發(fā)生。實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析接種小麥穗中PDS基因的相對(duì)表達(dá)量,結(jié)果發(fā)現(xiàn):相對(duì)于接種BSMV:00的麥穗,接種BSMV:PDS后發(fā)生光漂白的麥穗中PDS基因的相對(duì)表達(dá)量明顯下降。(4)BSMV病毒誘導(dǎo)1Dx2基因沉默。以1Dx5基因?yàn)槟０蹇寺×?個(gè)目的基因片段,分別命名為KL-1、KL-2、KL-3,構(gòu)建VIGS重組載體。小麥開(kāi)花12天后,在麥穗上分別摩擦接種BSMV:KL-1、BSMV:KL-2、BSMV:KL-3,同時(shí)接種BSMV:00為對(duì)照。實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析接種麥穗中1Dx2基因的相對(duì)表達(dá)量,結(jié)果發(fā)現(xiàn):在小麥穗中接種構(gòu)建的3個(gè)VIGS重組載體,其1Dx2基因的相對(duì)表達(dá)量均有所下降,證明在植物中轉(zhuǎn)入同源基因,可能通過(guò)RNA干擾的作用引起內(nèi)源基因的沉默,為研究轉(zhuǎn)基因沉默提供理論依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：小麥 基因沉默 BSMV-VIGS 1Dx2基因
【學(xué)位授予單位】：新疆師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S512.1;Q943.2
【目錄】：

• 中文摘要3-5
• Abstract5-10
• 1 文獻(xiàn)綜述10-22
• 1.1 小麥轉(zhuǎn)基因育種研究進(jìn)展10-12
• 1.1.1 小麥轉(zhuǎn)基因育種概況10
• 1.1.2 小麥常用的轉(zhuǎn)基因方法10-12
• 1.2 小麥HMW-GS的組成與品質(zhì)的關(guān)系12-14
• 1.2.1 小麥HMW-GS的組成12-13
• 1.2.2 HMW-GS與小麥面粉品質(zhì)的關(guān)系13-14
• 1.3 轉(zhuǎn)基因植物遺傳表達(dá)的研究進(jìn)展14-17
• 1.3.1 外源基因在受體植物中的表達(dá)14-15
• 1.3.2 外源基因在受體植物中的遺傳15
• 1.3.3 外源基因在受體植物中的沉默15-17
• 1.4 大麥條斑花葉病毒（BSMV）誘導(dǎo)小麥基因沉默17-19
• 1.4.1 病毒誘導(dǎo)基因沉默（VIGS）的作用機(jī)制17-18
• 1.4.2 大麥條斑花葉病毒（BSMV）誘導(dǎo)小麥基因沉默18-19
• 1.5 研究目的、意義和內(nèi)容19-22
• 1.5.1 研究目的及意義19-20
• 1.5.2 研究?jī)?nèi)容20-22
• 2 花粉管通道法轉(zhuǎn)基因條件的優(yōu)化22-30
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料與方法22-26
• 2.1.1 實(shí)驗(yàn)材料22-23
• 2.1.2 實(shí)驗(yàn)方法23-26
• 2.2 結(jié)果與分析26-28
• 2.2.1 轉(zhuǎn)基因T0代種子的篩選26-27
• 2.2.2 授粉時(shí)間對(duì)基因轉(zhuǎn)化效率的影響27-28
• 2.3 討論28-30
• 3 轉(zhuǎn)基因小麥T1代種子外源基因的檢測(cè)和分析30-34
• 3.1 實(shí)驗(yàn)材料與方法30
• 3.1.1 實(shí)驗(yàn)材料30
• 3.1.2 實(shí)驗(yàn)方法30
• 3.2 結(jié)果與分析30-32
• 3.2.1 T0代陽(yáng)性種子的補(bǔ)胚、移栽30-31
• 3.2.2 轉(zhuǎn)基因T1代種子HMW-GS組成情況31-32
• 3.3 討論32-34
• 4 轉(zhuǎn) 1Dx5基因致小麥內(nèi)源 1Dx2基因沉默因素的探究34-50
• 4.1 實(shí)驗(yàn)材料與方法34-39
• 4.1.1 實(shí)驗(yàn)材料34-35
• 4.1.2 實(shí)驗(yàn)方法35-39
• 4.2 結(jié)果與分析39-49
• 4.2.1 目的基因片段的克隆與測(cè)序39-41
• 4.2.2 VIGS重組載體的構(gòu)建41-43
• 4.2.3 VIGS載體的線性化43-44
• 4.2.4 體外轉(zhuǎn)錄44-45
• 4.2.5 小麥穗部PDS基因沉默45-48
• 4.2.6 小麥穗部 1Dx2基因沉默48-49
• 4.3 討論49-50
• 5 結(jié)論50-52
• 參考文獻(xiàn)52-60
• 在讀期間發(fā)表的論文60-61
• 致謝61

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