本文關(guān)鍵詞：平潭水仙組培快繁和抗病基因的克隆與轉(zhuǎn)化

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【摘要】：中國水仙(Narcissus tazetta var. chinensis M. Roem.)屬石蒜科,水仙屬,著名觀賞植物物種,型色香獨特,極具觀賞價值,長久以來為十大名花之一。我國水仙主要分布在福建和浙江等地,福建水仙生產(chǎn)地位尤為突出,平潭島水仙花資源豐富,獨具特色,以“花期長、香味持久、植株矮壯”的三大特點著稱,且人工馴化時間不長,在觀賞品質(zhì)培育方面可塑性更強。本實驗以平潭水仙為材料,建立高效的組織快繁體系；成功從平潭水仙中克隆了兩個抗病基因,即幾丁質(zhì)酶基因和葡聚糖酶基因,并采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法進行了基因轉(zhuǎn)化,獲得了轉(zhuǎn)基因平潭水仙植株材料。主要研究結(jié)果如下。1、子房誘導(dǎo)愈傷組織途徑：以子房為外植體誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織速度快、質(zhì)量好；可以較好的分化形成小鱗莖。本實驗對含不同配比的6-BA和2,4-D的MS誘導(dǎo)培養(yǎng)基進行了篩選,在以子房為外植體的情況下可以誘導(dǎo)出2種不同類型的愈傷組織,黃色褶皺型和混合型,后者更為常見；實驗中所設(shè)計的不同配方培養(yǎng)基均可誘愈傷組織的形成,其中MS+0.75 mg/L 6-BA+0.5 mg/L 2,4-D誘導(dǎo)率最高,可達79.2%; MS+5.0 mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAA愈傷組織分化率最高,可達42.4%,分化系數(shù)為2.07; MS+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L 2,4-D+0.2 mg/L NAA愈傷組織分化率為30.3%,分化系數(shù)高達3.18,且小鱗莖分化質(zhì)量較好；分化過程中會出現(xiàn)組織褐化和小鱗莖玻璃化等異常現(xiàn)象。2、鱗莖盤直接誘導(dǎo)途徑：以平潭水仙鱗莖盤為外植體進行不定芽誘導(dǎo),實驗中對外植體消毒時間和消毒試劑NaClO的濃度進行了篩選,以6-BA、2,4-D、NAA為變量設(shè)計誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方。結(jié)果顯示：選用側(cè)球,用30%的NaClO消毒35 mmin,污染率較低,為39.1%；添加1.0 mg/L 6-BA和0.1 mg/L NAA的MS培養(yǎng)基誘導(dǎo)鱗莖盤產(chǎn)生不定芽的效果最好,63%的外植體可成功分化,分化系數(shù)為6.6；實驗中發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)形成小鱗莖的大小依據(jù)不同培養(yǎng)基配方而異；每組培養(yǎng)基中的鱗片都會有不同程度的生長異常,鱗莖盤的繼代培養(yǎng)效果不佳。3、花葶直接誘導(dǎo)途徑：以平潭水仙花葶為外植體可直接誘導(dǎo)形成不定芽,含5 mg/L 6-BA和0.2 mg/L NAA的MS培養(yǎng)基對花葶不定芽的誘導(dǎo)效果最好,MS+4mg/L6-BA +0.2mg/L NAA培養(yǎng)基中可促進分化的幼苗正常生長。4、平潭水仙抗病基因的克隆：依據(jù)中國水仙轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù),運用RT-PCR技術(shù)從平潭水仙中克隆了葡聚糖酶基因和幾丁質(zhì)酶基因；葡聚糖酶基因的ORF為：1887bp,共編碼628個氨基酸,具有Glyco-hydro-9結(jié)構(gòu)域；幾丁質(zhì)酶基因ORF為：918bp,編碼305個氨基酸,具有Chitinase-Glyco-hydro-19結(jié)構(gòu)域。5、平潭水仙抗病基因的轉(zhuǎn)化：利用In-Fusion技術(shù)構(gòu)建表達載體pBI121-glucanase和pB1121-chitinase,用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將其分別導(dǎo)入平潭水仙,通過提取抗性組織DNA進行PCR驗證,結(jié)果顯示為陽性,初步證明了相關(guān)基因已成功導(dǎo)入。
【關(guān)鍵詞】：平潭水仙 組培快繁 幾丁質(zhì)酶基因 葡聚糖酶基因 遺傳轉(zhuǎn)化
【學(xué)位授予單位】：福建農(nóng)林大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S682.21
【目錄】：

• 縮略詞表7-8
• 摘要8-10
• ABSTRACT10-12
• 第一章 前言12-20
• 1 平潭水仙資源概況12-14
• 2 中國水仙離體組織再生研究14-16
• 2.1 通過愈傷組織再生途徑14-15
• 2.2 通過直接誘導(dǎo)小鱗莖再生途徑15-16
• 2.2.1 鱗莖盤的消毒15-16
• 2.2.2 影響鱗莖再生的因素16
• 3 中國水仙遺傳轉(zhuǎn)化概況16-17
• 4 植物抗病基因工程的研究17-18
• 5 本研究的目的意義、內(nèi)容及技術(shù)路線18-20
• 5.1 目的意義18
• 5.2 主要研究內(nèi)容18-19
• 5.3 技術(shù)路線19-20
• 第二章 平潭水仙花組培快繁20-31
• 1 材料與方法20-23
• 1.1 植物材料20
• 1.2 試驗方法20-23
• 1.2.1 外植體的預(yù)處理和消毒20
• 1.2.2 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件20-21
• 1.2.3 水仙外植體的篩選21
• 1.2.4 子房愈傷組織的誘導(dǎo)與分化21-22
• 1.2.5 鱗莖盤不定芽的誘導(dǎo)22-23
• 1.2.6 花葶不定芽的誘導(dǎo)23
• 1.2.7 數(shù)據(jù)計算23
• 2 結(jié)果與分析23-28
• 2.1 水仙外植體的篩選23-24
• 2.2 子房愈傷組織的誘導(dǎo)與分化24-26
• 2.2.1 子房愈傷組織的誘導(dǎo)24-25
• 2.2.2 子房愈傷組織的分化25-26
• 2.3 鱗莖盤直接誘導(dǎo)不定芽26-28
• 2.4 花葶直接誘導(dǎo)不定芽28
• 3 討論28-31
• 3.1 水仙不同外植體的消毒方法28-29
• 3.2 激素配比對水仙外植體分化的影響29-30
• 3.3 鱗莖的生根與移栽30-31
• 第三章 中國水仙抗病基因的克隆31-44
• 1 材料及方法31-32
• 1.1 試驗材料31
• 1.1.1 植物材料31
• 1.1.2 菌株、載體、試劑和試驗引物31
• 1.2 方法31-32
• 1.2.1 材料處理32
• 1.2.2 總RNA的獲得和檢測及cDNA的合成32
• 1.2.3 目的基因的PCR擴增32
• 1.2.4 目的片段的回收純化、連接、轉(zhuǎn)化及鑒定32
• 1.2.5 目的基因生物信息學(xué)分析32
• 2 結(jié)果與分析32-42
• 2.1 葡聚糖酶基因的克隆和分析32-38
• 2.1.1 葡聚糖酶基因的克隆32-35
• 2.1.2 葡聚糖酶基因生物信息學(xué)分析35-38
• 2.2 幾丁質(zhì)酶基因的克隆和分析38-42
• 2.2.1 幾丁質(zhì)酶基因序列分析38-40
• 2.2.2 幾丁質(zhì)酶基因生物信息學(xué)分析40-42
• 3 討論42-44
• 第四章 平潭水仙抗病相關(guān)基因的遺傳轉(zhuǎn)化44-51
• 1 試驗材料44
• 1.1 植物材料44
• 1.2 質(zhì)粒、菌株和試劑44
• 1.3 培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件44
• 2 試驗方法44-47
• 2.1 水仙花葶的卡那霉素敏感性實驗44
• 2.2 載體構(gòu)建44-46
• 2.2.1 目的基因的獲得44-45
• 2.2.2 pBI121質(zhì)粒制備及酶切45
• 2.2.3 目的片段與表達載體的連接、轉(zhuǎn)化和檢測45
• 2.2.4 載體構(gòu)建流程45-46
• 2.3 轉(zhuǎn)基因植株的獲取與檢測46-47
• 2.3.1 農(nóng)桿菌GV3101的活化和感受態(tài)制備46-47
• 2.3.2 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌47
• 2.3.3 農(nóng)桿菌侵染和抗性再生芽的獲得47
• 2.3.4 轉(zhuǎn)基因植株的PCR檢測47
• 3 結(jié)果與分析47-49
• 3.1 水仙花葶的卡那霉素敏感性實驗48
• 3.2 表達載體的構(gòu)建結(jié)果48
• 3.3 抗性再生不定芽的PCR鑒定48-49
• 4 討論49-51
• 小結(jié)與展望51-53
• 參考文獻53-57
• 附錄：圖版和圖版說明57-63
• 致謝63

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本文編號：640368