本文關(guān)鍵詞：農(nóng)桿菌介導(dǎo)LYZ-GFP雙元基因?qū)?個(gè)苜蓿品種的轉(zhuǎn)化及其表達(dá)分析

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【摘要】：苜蓿(Medicago sativa L.)是目前我國種植最廣的豆科牧草,尤其在西北、華北和東北的苜蓿主產(chǎn)區(qū),但是病害往往威脅著苜蓿的生產(chǎn),病發(fā)嚴(yán)重可造成大面積減產(chǎn),極大地限制了優(yōu)良牧草在畜牧業(yè)中的利用與營養(yǎng)潛力的發(fā)揮。為此,本研究以甘農(nóng)1號(hào)雜花苜蓿、甘農(nóng)3號(hào)紫花苜蓿,及和田紫花苜蓿為供試材料,優(yōu)化了3個(gè)品種的植株再生體系;利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將LYZ-GFP雙元基因?qū)?個(gè)苜蓿品種中,并分析了轉(zhuǎn)化過程中的各影響因素,優(yōu)化了遺傳轉(zhuǎn)化條件;對(duì)獲得的轉(zhuǎn)化植株進(jìn)行了熒光檢測(cè)和目的基因PCR檢測(cè),成功獲得了具有目的基因(溶菌酶基因)的甘農(nóng)1號(hào)及和田苜蓿的轉(zhuǎn)基因植株,為轉(zhuǎn)基因抗病苜蓿新品種的最終形成奠定了研究基礎(chǔ)。具體研究內(nèi)容及結(jié)果如下:。1.進(jìn)行3個(gè)苜蓿品種植株再生和遺傳轉(zhuǎn)化的研究,優(yōu)化了苜蓿再生體系和遺傳轉(zhuǎn)化條件。以苜蓿3個(gè)品種的下胚軸為外植體,進(jìn)行消毒方式對(duì)種子消毒效果、愈傷組織誘導(dǎo)、分化及遺傳轉(zhuǎn)化影響因素的研究。結(jié)果表明:品種G1、G3、HT最適的消毒方式為20%次氯酸鈉處理25min,該處理?xiàng)l件下三者發(fā)芽率均最高,分別是93%、84%、97.5%;獲得3個(gè)苜蓿品種愈傷組織誘導(dǎo)和分化的較成熟體系,MS培養(yǎng)基+2mg/L2,4-D+0.5mg/LKT處理?xiàng)l件下,G1、G3、HT的出愈率分別為98.5%、90%、99.5%;在愈傷分化階段,當(dāng)NAA濃度為0.5mg/L時(shí),G1和G3的分化率達(dá)到最大,分別為74%和47%,當(dāng)NAA濃度為0.05mg/L時(shí),HT分化率最大,為62%。2.探索了三個(gè)苜蓿品種試管苗微繁的最適濃度生長調(diào)節(jié)劑,優(yōu)化了適宜轉(zhuǎn)基因試管苗大量擴(kuò)繁的穩(wěn)定條件本試驗(yàn)以甘農(nóng)3號(hào)(G3)、和田(HT)、隴東(LD)紫花苜蓿為材料,研究不同種類和濃度的生長調(diào)節(jié)劑吲哚丁酸(IBA)、萘乙酸(NAA)、生根粉(ABT)對(duì)苜蓿微扦插試管苗生長的影響。結(jié)果表明:0.2mg/LNAA處理下的甘農(nóng)3號(hào)紫花苜蓿試管苗生根率達(dá)100%,且具有較高的生根數(shù)(8),最大根長(17.5cm),株高和葉片數(shù)也顯著高于對(duì)照(CK)和其他處理(P0.05);0.1mg/LNAA處理下的和田紫花苜蓿試管苗的根系生長情況明顯優(yōu)于其他處理,生根率為100%,具有較高的生根數(shù)(7),最大根長(29.6cm),株高和葉片數(shù)也顯著高于對(duì)照(CK)和其他處理(P0.05);0.2mg/LNAA處理下的隴東紫花苜蓿試管苗的根系生長情況明顯優(yōu)于其他處理,生根率100%,并具有較高的生根數(shù)(7),最大根長(10.2cm),株高和葉片數(shù)也顯著高于對(duì)照(CK)和其他處理(P0.05)。因此,在設(shè)置的濃度梯度下,甘農(nóng)3號(hào)和隴東紫花苜蓿微扦插試管苗生長的最適生長調(diào)節(jié)劑及其濃度是0.2mg/LNAA,適于和田紫花苜蓿的是0.1mg/LNAA。3.獲得了含有目的基因的轉(zhuǎn)基因植株,經(jīng)PCR和熒光定量檢測(cè),取得了陽性證據(jù)。對(duì)轉(zhuǎn)化植株進(jìn)行熒光檢測(cè)和PCR檢測(cè),篩選含有LYZ-GFP雙元基因的轉(zhuǎn)基因植株熒光跟蹤顯微檢測(cè),發(fā)現(xiàn)G1、G3、HT的愈傷組織均存在發(fā)綠色熒光的愈傷組織;對(duì)G1和HT抗性植株進(jìn)行葉片熒光檢測(cè),檢測(cè)結(jié)果顯示,葉片發(fā)綠色熒光;提取熒光檢測(cè)呈陽性的G1和HT抗性植株DNA,進(jìn)行GFP基因和LYZ基因PCR擴(kuò)增分析,結(jié)果顯示:6株甘農(nóng)1號(hào)雜花苜蓿熒光檢測(cè)陽性植株經(jīng)PCR擴(kuò)增后,均出現(xiàn)750bp的GFP基因條帶,其中4株擴(kuò)增后出現(xiàn)500bp的LYZ基因條帶,1株和田擴(kuò)增出500bp的Lyz基因條帶。
【關(guān)鍵詞】：苜蓿 農(nóng)桿菌介導(dǎo) 綠色熒光蛋白GFP基因 溶菌酶Lyz基因 愈傷組織分化 植株再生 生長調(diào)節(jié)劑 熒光檢測(cè) 轉(zhuǎn)基因植株
【學(xué)位授予單位】：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S541.9
【目錄】：

• 項(xiàng)目來源2-3
• 摘要3-5
• SUMMARY5-10
• 縮寫詞(ABBREVIATION)10-11
• 前言11-13
• 第一章 文獻(xiàn)綜述13-30
• 1 苜蓿轉(zhuǎn)基因研究進(jìn)展13-23
• 1.1 苜蓿再生體（組織培養(yǎng)）研究進(jìn)展13-15
• 1.2 苜蓿遺傳轉(zhuǎn)化受體研究進(jìn)展15-17
• 1.2.1 愈傷組織再生系統(tǒng)16
• 1.2.2 原生質(zhì)體受體系統(tǒng)16-17
• 1.2.3 胚狀體再生系統(tǒng)17
• 1.2.4 直接分化再生系統(tǒng)17
• 1.2.5 生殖細(xì)胞受體系統(tǒng)17
• 1.3 苜蓿遺傳轉(zhuǎn)化研究進(jìn)展17-22
• 1.3.1 農(nóng)桿菌介導(dǎo)法在苜蓿中的應(yīng)用18-20
• 1.3.2 基因槍法20
• 1.3.3 DNA直接轉(zhuǎn)移導(dǎo)入原生質(zhì)體20-21
• 1.3.4 顯微注射法21
• 1.3.5 花粉管通道法21-22
• 1.4 苜�？共⌒赃z傳轉(zhuǎn)化研究進(jìn)展22-23
• 2 綠色熒光蛋白基因及其應(yīng)用23-26
• 2.1 綠色熒光蛋白（GFP）基因的結(jié)構(gòu)及其發(fā)光機(jī)理23-24
• 2.2 GFP在轉(zhuǎn)基因研究中作為標(biāo)記基因的幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)24-25
• 2.3 GFP在轉(zhuǎn)基因研究中的應(yīng)用25-26
• 3 溶菌酶的應(yīng)用進(jìn)展26-29
• 3.1 溶菌酶的結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)及其抗菌作用26-27
• 3.2 溶菌酶的分類27
• 3.2.1 植物溶菌酶27
• 3.2.2 動(dòng)物溶菌酶27
• 3.2.3 微生物溶菌酶27
• 3.2.4 噬菌體溶菌酶27
• 3.3 溶菌酶的應(yīng)用27-29
• 3.3.1 溶菌酶在食品上的應(yīng)用28
• 3.3.2 溶菌酶在醫(yī)藥上的應(yīng)用28
• 3.3.3 溶菌酶在生物工程上的應(yīng)用28-29
• 4 本課題的研究目的與意義29-30
• 第二章 紫花苜蓿高效再生體系的建立和優(yōu)化30-36
• 2.1 試驗(yàn)材料30
• 2.1.1 植物材料30
• 2.1.2 試驗(yàn)試劑與植物激素30
• 2.1.3 主要試驗(yàn)儀器30
• 2.1.4 培養(yǎng)基30
• 2.2 試驗(yàn)方法30-32
• 2.2.1 種子消毒以及外植體的獲得30-32
• 2.2.2 愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)32
• 2.2.3 愈傷組織分化培養(yǎng)32
• 2.2.4 再生植株移栽32
• 2.2.5 數(shù)據(jù)處理32
• 2.3 結(jié)果與分析32-34
• 2.3.1 消毒方式對(duì)種子污染情況及發(fā)芽率的影響32-33
• 2.3.2 愈傷組織誘導(dǎo)33-34
• 2.3.3 愈傷組織分化34
• 2.4 討論34-36
• 2.4.1 苜蓿種子消毒方式分析34-35
• 2.4.2 苜蓿愈傷誘導(dǎo)35
• 2.4.3 苜蓿愈傷組織分化35-36
• 第三章 生長調(diào)節(jié)劑對(duì)苜蓿微扦插試管苗生長的影響36-44
• 3.1 供試材料36
• 3.2 試驗(yàn)方法36-37
• 3.2.1 試管苗插穗的獲得36
• 3.2.2 不同濃度生長調(diào)節(jié)劑及測(cè)定指標(biāo)36-37
• 3.2.3 數(shù)據(jù)處理37
• 3.3 結(jié)果與分析37-42
• 3.3.1 生長調(diào)節(jié)劑對(duì)甘農(nóng)3號(hào)（G3）紫花苜蓿微扦插試管苗生長狀況的影響37-39
• 3.3.2 生長調(diào)節(jié)劑對(duì)和田（HT）紫花苜蓿微扦插試管苗生長狀況的影響39-40
• 3.3.3 生長調(diào)節(jié)劑對(duì)隴東（LD）紫花苜蓿微扦插試管苗生長狀況的影響40-42
• 3.4 討論42-44
• 第四章 苜蓿遺傳轉(zhuǎn)化體系的優(yōu)化44-48
• 4.1 試驗(yàn)材料44
• 4.1.1 材料44
• 4.1.2 生化試劑44
• 4.1.3 農(nóng)桿菌培養(yǎng)基44
• 4.1.4 主要試驗(yàn)儀器44
• 4.2 試驗(yàn)方法44-45
• 4.2.1 工程菌的純化及農(nóng)桿菌侵染液的制備44-45
• 4.2.2 侵染受體材料的確定45
• 4.2.3 選擇壓卡那霉素（Kan）濃度的確定45
• 4.3 結(jié)果與分析45-47
• 4.3.2 侵染受體材料的確定45-46
• 4.3.3 選擇壓卡那霉素（Kan）濃度的確定46-47
• 4.4 討論47-48
• 4.4.1 農(nóng)桿菌侵染的受體材料的優(yōu)化47
• 4.4.2 卡那霉素（Kan）有效濃度分析47-48
• 第五章 轉(zhuǎn)化植株的熒光檢測(cè)與目的基因的PCR檢測(cè)48-55
• 5.1 試驗(yàn)材料48
• 5.1.1 植物材料48
• 5.1.2 試驗(yàn)儀器48
• 5.2 試驗(yàn)方法48-50
• 5.2.1 熒光檢測(cè)48
• 5.2.2 PCR檢測(cè)48-50
• 5.3 結(jié)果與分析50-53
• 5.3.1 熒光檢測(cè)50-51
• 5.3.2 PCR檢測(cè)51-53
• 5.4 討論53-55
• 第六章 結(jié)論與展望55-57
• 6.1 結(jié)論55-56
• 6.2 展望56-57
• 參考文獻(xiàn)57-63
• 附圖63-64
• 致謝64-65
• 作者簡介65-66
• 導(dǎo)師簡介66-67

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：630303