本文關(guān)鍵詞：中國(guó)櫻桃花芽油菜素內(nèi)酯合成相關(guān)基因克隆與功能分析

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【摘要】：櫻桃(Prunnes pseudocerasus)屬于薔薇科李亞科落葉喬木果樹(shù),中國(guó)櫻桃品種繁多,浙江地區(qū)的‘短柄’櫻桃以其自花結(jié)果性好、早產(chǎn)、果實(shí)相對(duì)比較大、豐產(chǎn)、適應(yīng)性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)成為該地區(qū)主要優(yōu)良栽培品種之一,也是重要的科研材料。對(duì)于落葉果樹(shù)而言,只有滿足需冷量,才能正常開(kāi)花,否則會(huì)導(dǎo)致開(kāi)花不整齊,影響果實(shí)的品質(zhì)與產(chǎn)量。近年來(lái),落葉果樹(shù)休眠及其調(diào)控機(jī)制已成為研究的熱點(diǎn),對(duì)自然休眠的調(diào)控也成為落葉果樹(shù)栽培過(guò)程中亟待解決的問(wèn)題。伴隨著分子生物學(xué)的不斷發(fā)展,人們對(duì)落葉果樹(shù)休眠的研究已經(jīng)深入到分子水平。大量研究表明,休眠的各個(gè)階段受內(nèi)源激素(ABA、IAA、GA等)調(diào)控。油菜素內(nèi)酯為固醇類激素,在解除種子休眠促進(jìn)萌發(fā)、細(xì)胞分裂、細(xì)胞伸長(zhǎng)、生殖器官形成及光形態(tài)建成等方面具有重要的作用。但在落葉果樹(shù)花芽休眠與休眠解除過(guò)程中的作用與調(diào)控機(jī)制報(bào)道較少,因此,本研究對(duì)油菜素內(nèi)酯在花芽休眠解除中的作用做了探討。本研究從中國(guó)櫻桃轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)(GeneBank登錄號(hào)SRX695147)中獲得4個(gè)油菜素內(nèi)酯合成基因,并通過(guò)生物信息學(xué)分析、實(shí)時(shí)熒光定量PCR (qRT-PCR)、瞬時(shí)表達(dá)、遺傳轉(zhuǎn)化等技術(shù),對(duì)其表達(dá)與功能進(jìn)行了研究,主要研究結(jié)果如下：(1)通過(guò)對(duì)中國(guó)櫻桃轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行篩選,從中獲得4個(gè)油菜素內(nèi)酯合成基因,基因編號(hào)分別為Unigene12256、Unigene2085、Unigene2065和Unigene5028。通過(guò)對(duì)其進(jìn)行蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)、疏水性及同源性比對(duì)等生物信息學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)它們分別與梅和蘋(píng)果等植物的DET2、BR6ox、DWF4和CPD同源性很高,因此將它們分別命名為Unigene12256(PpcDET2)、Unigene2085(PpcBR6ox)、Unigene2065(PpcDWF4)、 Unigene5028 (PpcCPD)。(2)分別對(duì)休眠的櫻桃枝條和葉片進(jìn)行不同處理,通過(guò)實(shí)qRT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn),隨著低溫的積累,PpcDWF4的表達(dá)量變化無(wú)規(guī)律,PpcCPD的表達(dá)量下調(diào),而PpcDET2和PpcBR6ox基因的表達(dá)量都上調(diào),但是PpcBR6ox基因上調(diào)比較顯著,高達(dá)39倍。因此推測(cè)PpcBR6ox基因可能通過(guò)響應(yīng)低溫積累參與櫻桃花芽休眠狀態(tài)調(diào)控。(3)為了進(jìn)一步探索PpcBR6ox基因的表達(dá)調(diào)控與低溫的關(guān)系,采用常規(guī)PCR技術(shù)從櫻桃基因組DNA中分離了PpcBR6ox基因啟動(dòng)子,通過(guò)PlantCare在線軟件預(yù)測(cè)分析發(fā)現(xiàn)該啟動(dòng)子內(nèi)部含有低溫響應(yīng)、光響應(yīng)等作用元件。通過(guò)構(gòu)建pGreenⅡ0800-Luc瞬時(shí)表達(dá)載體,通過(guò)與CBF轉(zhuǎn)錄因子互作研究,發(fā)現(xiàn)LUC與REN比值比陰性對(duì)照高3.5倍,說(shuō)明PpcBR6ox基因啟動(dòng)子與CBF轉(zhuǎn)錄因子存在明顯互作關(guān)系。推測(cè)PpcBR6ox基因被低溫誘導(dǎo)表達(dá)可能是通過(guò)CBF信號(hào)途徑介導(dǎo)的。(4)為了進(jìn)一步確定PpcBR6ox基因功能,從中國(guó)櫻桃花芽中克隆了PpcBR6ox基因cDNA全長(zhǎng)序列,并構(gòu)建了超表達(dá)載體,利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的花序浸染法遺傳轉(zhuǎn)化擬南芥,通過(guò)潮霉素B篩選,PCR檢測(cè),獲得PpcBR6ox轉(zhuǎn)基因擬南芥株系。分別對(duì)轉(zhuǎn)基因擬南芥和野生型擬南芥種子進(jìn)行萌發(fā)試驗(yàn),發(fā)現(xiàn)萌發(fā)48 h后,轉(zhuǎn)基因擬南芥種子的萌發(fā)率接近90%,野生型種子的萌發(fā)率僅為10%左右,轉(zhuǎn)基因種子的萌發(fā)率明顯高于野生型。說(shuō)明擬南芥中超量表達(dá)PpcBR6ox基因有助于種子休眠解除,促進(jìn)種子萌發(fā)。我們推測(cè)PpcBR6ox基因可能也會(huì)促進(jìn)櫻桃花芽休眠解除,促進(jìn)萌發(fā)。(5)為研究PpcBR6ox基因表達(dá)與芽休眠的關(guān)系,又將PpcBR6ox基因通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤(pán)轉(zhuǎn)化法遺傳轉(zhuǎn)化毛白楊,經(jīng)抗性篩選和PCR鑒定,已獲得了48株轉(zhuǎn)基因楊樹(shù)幼苗,為下一步研究PpcBR6ox基因?qū)γ讞顐?cè)芽生長(zhǎng)發(fā)育和休眠的影響奠定了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：中國(guó)櫻桃 休眠 油菜素內(nèi)酯 PpcBR6ox基因 啟動(dòng)子
【學(xué)位授予單位】：浙江師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：Q943.2;S662.5
【目錄】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-9
• 縮略詞9-14
• 第一章 文獻(xiàn)綜述14-25
• 1 油菜素內(nèi)酯的分布14-15
• 2 油菜素內(nèi)酯的合成15-16
• 3 油菜素內(nèi)酯的合成途徑的調(diào)節(jié)16-17
• 4 油菜素內(nèi)酯的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制17-20
• 4.1 油菜素內(nèi)酯在質(zhì)膜上的受體-BRI1和BAK117-18
• 4.2 BR信號(hào)的導(dǎo)出18
• 4.3 BR信號(hào)的傳遞18-20
• 5 油菜素內(nèi)酯在植物生長(zhǎng)發(fā)育中的作用20-22
• 5.1 油菜素內(nèi)酯促進(jìn)細(xì)胞分裂、細(xì)胞伸長(zhǎng)20-21
• 5.2 油菜素內(nèi)酯促進(jìn)維管束發(fā)育21
• 5.3 油菜素內(nèi)酯調(diào)控植物的生殖發(fā)育21
• 5.4 油菜素內(nèi)酯促進(jìn)種子萌發(fā)21-22
• 5.5 油菜素內(nèi)酯提高植物對(duì)外界環(huán)境的脅迫反應(yīng)22
• 5.6 油菜素內(nèi)酯促進(jìn)農(nóng)作物的生長(zhǎng)發(fā)育22
• 6 落葉果樹(shù)休眠機(jī)理22-23
• 7 研究目的及意義23-25
• 第二章 中國(guó)櫻桃油菜素內(nèi)酯合成相關(guān)基因克隆與分析25-33
• 1 前言25-26
• 2 材料與方法26-27
• 2.1 植物材料26
• 2.2 酶及相關(guān)試劑盒26
• 2.3 基因序列獲取26
• 2.4 油菜素內(nèi)酯合成基因生物信息學(xué)分析26-27
• 3 結(jié)果與分析27-31
• 3.1 中國(guó)櫻桃油菜素內(nèi)酯合成相關(guān)基因生物信息學(xué)分析27-30
• 3.2 中國(guó)櫻桃油菜素內(nèi)酯合成基因系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析30-31
• 4 討論31-33
• 第三章 中國(guó)櫻桃花芽油菜素內(nèi)酯相關(guān)合成基因的表達(dá)分析33-51
• 1 前言33-34
• 2 材料與方法34-40
• 2.1 材料34
• 2.1.1 植物材料34
• 2.1.2 載體與菌株34
• 2.1.3 試劑34
• 2.2 方法34-37
• 2.2.1 RNA的提取34-35
• 2.2.2 cDNA一鏈的合成35-36
• 2.2.3 基因組DNA的提取36-37
• 2.3 櫻桃油菜素內(nèi)酯合成基因的表達(dá)分析37-40
• 2.3.1 材料的處理37
• 2.3.2 櫻桃油菜素內(nèi)酯合成基因的表達(dá)分析37-38
• 2.3.3 中國(guó)櫻桃PpcBR6ox基因的分離38
• 2.3.4 中國(guó)櫻桃PpcBR6ox基因啟動(dòng)子的分離38-39
• 2.3.5 PpcBR6ox基因啟動(dòng)子瞬時(shí)表達(dá)載體的構(gòu)建39
• 2.3.6 瞬時(shí)表達(dá)分析39-40
• 3 結(jié)果與分析40-49
• 3.1 櫻桃花芽休眠過(guò)程中油菜素內(nèi)酯合成基因的表達(dá)分析40-44
• 3.1.1 櫻桃花芽總RNA的提取40-41
• 3.1.2 低溫處理下櫻桃花芽中油菜素內(nèi)酯合成基因的表達(dá)分析41-42
• 3.1.3 低溫黑暗處理下櫻桃花芽中油菜素內(nèi)酯合成基因的表達(dá)分析42-43
• 3.1.4 低溫處理下櫻桃葉片中PpcBR6ox基因的表達(dá)分析43-44
• 3.2 PpcBR6ox基因的分離44
• 3.3 PpcBR6ox基因啟動(dòng)子功能初探44-49
• 3.3.1 PpcBR6ox基因啟動(dòng)子的分離44-45
• 3.3.2 PpcBR6ox基因啟動(dòng)子生物信息學(xué)分析45-46
• 3.3.3 PpcBR6ox基因啟動(dòng)子表達(dá)載體的構(gòu)建46-47
• 3.3.4 PpcBR6ox基因啟動(dòng)子瞬時(shí)表達(dá)分析47-48
• 3.3.5 PpcBR6ox基因啟動(dòng)子相互作用關(guān)系的研究48-49
• 4 討論49-51
• 第四章 中國(guó)櫻桃PpcBR6ox基因功能研究51-65
• 1 前言51
• 2 材料與方法51-56
• 2.1 植物材料51-52
• 2.2 載體與菌株52
• 2.3 試劑52
• 2.4 相關(guān)培養(yǎng)基的配置52-53
• 2.4.1 擬南芥遺傳轉(zhuǎn)化相關(guān)培養(yǎng)基52
• 2.4.2 毛白楊遺傳轉(zhuǎn)化相關(guān)培養(yǎng)基52-53
• 2.5 中國(guó)櫻桃PpcBR6ox基因超表達(dá)載體的構(gòu)建53-54
• 2.6 擬南芥的遺傳轉(zhuǎn)化及篩選54-55
• 2.6.1 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的花序浸染法遺傳轉(zhuǎn)化擬南芥54
• 2.6.2 T_0代擬南芥潮霉素抗性種子的篩選54-55
• 2.7 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤(pán)轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化毛白楊55-56
• 2.7.1 外植體的獲得55
• 2.7.2 獲取菌液55
• 2.7.3 侵染55
• 2.7.4 篩選55-56
• 2.7.5 誘導(dǎo)不定芽56
• 2.7.6 不定芽生根56
• 2.7.7 煉苗及移栽56
• 2.7.8 抗性苗的檢測(cè)56
• 3 結(jié)果與分析56-63
• 3.1 櫻桃PpcBR6ox基因超表達(dá)載體的構(gòu)建56-57
• 3.2 轉(zhuǎn)基因擬南芥的獲得及表型分析57-61
• 3.2.1 潮霉素抗性苗的基因組DNA的提取及分子檢測(cè)57-58
• 3.2.2 光照長(zhǎng)度對(duì)轉(zhuǎn)基因擬南芥種子萌發(fā)的影響58-61
• 3.3 楊樹(shù)遺傳轉(zhuǎn)化61-62
• 3.4 轉(zhuǎn)基因毛白楊的鑒定62-63
• 4 討論63-65
• 展望65-66
• 參考文獻(xiàn)66-74
• 附錄 基因序列74-78
• 攻讀學(xué)位期間取得的研究成果78-80
• 致謝80-84

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本文編號(hào)：628902