本文關(guān)鍵詞：豬卵母細胞體外成熟調(diào)控和MPF、MAPK基因表達研究

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【摘要】：本試驗對豬卵母細胞體外成熟及受精技術(shù)體系展開了一系列研究,以期獲得高質(zhì)量成熟卵母細胞,降低精子多精入卵現(xiàn)象,提高胚胎可移植效率,從而建立高效的人工授精胚胎體外生產(chǎn)技術(shù)體系。1、促性腺激素對豬卵母細胞體外成熟和孤雌胚發(fā)育的影響。本研究旨在探討不同濃度的促性腺激素(FSH、LH)以及處理時間對豬卵母細胞體外成熟質(zhì)量及其后期發(fā)育潛力的影響。試驗中,培養(yǎng)液中FSH、LH濃度均為10ug/m L且處理42h為對照組A,豬卵母細胞在不同濃度促性腺激素以及處理時間中培養(yǎng)42 h后,通過豬卵母細胞核的進程、存活率、極體率以及卵子內(nèi)谷胱甘肽(GSH)含量等質(zhì)量指標的評價,探討成熟液中促性腺激素的最佳添加量以及處理的時間,再通過孤雌胚體外發(fā)育潛力研究,進一步驗證該成熟培養(yǎng)體系。結(jié)果表明,4組卵子成熟培養(yǎng)42h都能到達核成熟階段,存活率和極體率之間差異均不顯著(P0.05);試驗組單個卵母細胞內(nèi)GSH含量顯著高于對照組A(P0.05),其中全程添加FSH和LH,且濃度為1ug/m L的組別單個卵母細胞內(nèi)GSH含量最高。此外,全程添加FSH和LH,且濃度為1ug/m L的試驗組孤雌激活后卵裂率和囊胚率均顯著高于對照組(P0.05)。試驗結(jié)果證明,在豬卵母細胞體外成熟液中全程添加促性腺激素且濃度為1ug/mL,可顯著提高卵子成熟質(zhì)量及后期發(fā)育潛力。2、褪黑素對豬卵母細胞體外成熟和孤雌胚發(fā)育的影響。探討成熟液中不同濃度褪黑素對豬卵母細胞體外成熟質(zhì)量及其后期發(fā)育潛力的影響。試驗中,0mol/L為對照組,豬卵母細胞在不同MT濃度(0mol/L、10-6mol/L、10-9mol/L和10-12mol/L)的成熟液中培養(yǎng)42 h后,通過豬卵母細胞存活率、極體率、卵子內(nèi)谷胱甘肽(GSH)含量以及胞質(zhì)內(nèi)線粒體和脂肪顆粒成熟分布狀態(tài)等質(zhì)量指標的評價,探討成熟液中褪黑素(melatonin,MT)最佳添加量,再通過孤雌胚體外發(fā)育潛力研究,進一步驗證該成熟培養(yǎng)體系。結(jié)果表明,4組卵子存活率和極體率之間差異均不顯著(P0.05);試驗組單個卵子中GSH含量均顯著高于對照組(P0.05);而且,試驗組卵子內(nèi)脂肪顆粒和線粒體成熟分布等質(zhì)量指標也顯著優(yōu)于對照組(P0.05);此外,孤雌激活后10-6mol/L和10-9mol/L組卵裂率和囊胚率均顯著高于對照組(P0.05)。試驗結(jié)果證明,在豬卵母細胞體外成熟液中添加10-9mol/L-10-6mol/L的MT,可顯著提高卵子成熟質(zhì)量及后期發(fā)育潛力。3、褪黑素對卵母細胞MPF和MAPK基因表達的影響。試驗采用兩種提取RNA的提取方法,并對不同濃度下培養(yǎng)的卵母細胞內(nèi)MPF和MAPK基因的mRNA表達進行分析。結(jié)果表明體外成熟培養(yǎng)液中褪黑素濃度為10-9mol/L時,成熟的卵母細胞中的MPF和MAPK基因mRNA表達量同時上調(diào),且顯著高于對照組(P0.05)。4、咖啡因?qū)ωi精子獲能以及體外受精的影響。試驗探討了不同濃度咖啡因?qū)ωi精子活力、存活時間以及體外受精的影響。試驗中,0 mmol/L為對照組,豬精子在不同濃度咖啡因(0、2.5、5、10、20mmol/L)的受精液中獲能,每隔30min對精子的活力進行測定,直至活力低于0.6.選擇活力最強時候的時間點進行體外受精。結(jié)果表明:(1)咖啡因濃度為10、20mmol/L組,獲能90min后精子活力明顯低于0.6,其他組精子活力均要高于0.6;(2)咖啡因可以顯著提高精子入卵率,咖啡因濃度為20mmol/L時多精入卵率顯著高于對照組(P0.05);(3)咖啡因濃度為2.5~5.0mmol/L時,更有利于后期胚胎發(fā)育。體外成熟培養(yǎng)體系的建立,提高了卵母細胞成熟的質(zhì)量,對豬胚胎生物技術(shù)方面研究具有重要的參考價值。
【關(guān)鍵詞】：卵母細胞 促性腺激素 褪黑素 體外成熟 MFP MAPK 豬
【學(xué)位授予單位】：天津農(nóng)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S828
【目錄】：

• 摘要11-13
• Abstract13-16
• 第一章 引言16-30
• 1 豬卵母細胞體外成熟研究進展16-25
• 1.1 卵母細胞的體外成熟特征16-17
• 1.2 谷胱甘肽、線粒體及脂肪顆粒與卵母細胞成熟的關(guān)系17-19
• 1.3 卵母細胞成熟過程中MPF和MAPK的變化規(guī)律19-21
• 1.4 影響卵母細胞體外成熟的因素21-24
• 1.5 培養(yǎng)條件24-25
• 2 豬卵母細胞體外受精研究進展25-28
• 2.1 精子獲能25-27
• 2.2 精子獲能效果的評定27-28
• 3 孤雌激活28-29
• 4 早期胚胎的體外培養(yǎng)29-30
• 第二章 促性腺激素對豬卵母細胞體外成熟和孤雌胚發(fā)育的影響30-42
• 1 材料與方法30-35
• 1.1 試驗材料30
• 1.2 試劑及儀器設(shè)備30
• 1.3 主要溶液配制30-32
• 1.4 方法32-34
• 1.5 試驗設(shè)計34
• 1.6 統(tǒng)計分析34-35
• 2 結(jié)果與分析35-39
• 2.1 不同濃度的促性腺激素和處理時間對豬卵母細胞核成熟的影響35-37
• 2.2 不同濃度的促性腺激素和處理時間對豬卵母細胞存活率以及極體率的影響37
• 2.3 不同濃度的促性腺激素和處理時間對豬卵母細胞內(nèi)谷胱甘肽含量影響的研究37-38
• 2.4 豬卵母細胞孤雌胚發(fā)育潛力研究38-39
• 3 討論39-41
• 3.1 不同濃度促性腺激素和處理時間對卵母細胞核成熟的影響39-40
• 3.2 不同濃度促性腺激素和處理時間對GSH含量的影響40-41
• 4 小結(jié)41-42
• 第三章 褪黑素對豬卵母細胞體外成熟和孤雌胚發(fā)育的影響42-48
• 1 材料與方法42-43
• 1.1 試驗材料42
• 1.2 主要試劑的配制42
• 1.3 試驗方法42-43
• 1.4 試驗設(shè)計43
• 1.5 統(tǒng)計分析43
• 2 結(jié)果與分析43-47
• 2.1 褪黑素對豬卵母細胞活率和極體率影響的研究43-44
• 2.2 褪黑素對豬卵母細胞內(nèi)谷胱甘肽含量影響的研究44
• 2.3 豬卵母細胞脂肪顆粒和線粒體成熟分布狀態(tài)研究44-46
• 2.4 豬卵母細胞孤雌胚發(fā)育潛力研究46-47
• 3 討論47
• 3.1 褪黑素對豬卵母細胞活率和極體率影響的研究47
• 3.2 褪黑素對豬卵母細胞胞質(zhì)內(nèi)容物影響的研究47
• 4 小結(jié)47-48
• 第四章 褪黑素對卵母細胞MPF和MAPK基因表達的影響48-57
• 1 材料與方法48-51
• 1.1 試驗材料48
• 1.2 試劑及儀器設(shè)備48
• 1.3 試驗方法48-51
• 1.4 數(shù)據(jù)分析51
• 2 結(jié)果與分析51-55
• 2.1 兩種提取方法RNA純度分析51-52
• 2.2 溶解曲線和擴增曲線52-55
• 3 討論55-56
• 3.1 兩種提取RNA方法的比較55
• 3.2 褪黑素作用卵母細胞MPF和MAPK基因mRNA的表達55-56
• 4 小結(jié)56-57
• 第五章 咖啡因?qū)ωi精子獲能以及體外受精的影響57-62
• 1 材料與方法57-59
• 1.1 材料57
• 1.2 主要試劑的配制57-58
• 1.3 方法58
• 1.4 試驗設(shè)計58
• 1.5 統(tǒng)計分析58-59
• 2 結(jié)果與分析59-60
• 2.1 咖啡因?qū)硬煌瑫r間活力的影響59
• 2.2 咖啡因?qū)w外受精影響59-60
• 3 討論60-61
• 3.1 咖啡因?qū)β涯讣毎盍按婊顣r間的影響60-61
• 3.2 咖啡因?qū)芋w外受精的影響61
• 4 小結(jié)61-62
• 結(jié)論62-63
• 參考文獻63-72
• 致謝72-73
• 攻讀碩士期間發(fā)表的論文73

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