本文關(guān)鍵詞：甘藍(lán)醛酮還原酶基因?qū)π〔硕隇楹Φ捻憫?yīng)及其轉(zhuǎn)基因植株的構(gòu)建

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【摘要】：植物醛酮還原酶是植物體中重要的解毒酶,在植物防御非生物脅迫中起關(guān)鍵作用。本實驗室發(fā)現(xiàn)正常和機械損傷的甘藍(lán)釋放苯甲醛,而小菜蛾為害后甘藍(lán)釋放的揮發(fā)性物質(zhì)中沒有苯甲醛而有苯甲醇,因此醛酮還原酶可能在植物應(yīng)對害蟲為害中發(fā)揮作用。本研究利用qRT-PCR技術(shù)分析甘藍(lán)受小菜蛾脅迫后甘藍(lán)醛酮還原酶基因表達(dá)量的變化,結(jié)果發(fā)現(xiàn)甘藍(lán)在受到小菜蛾取食2h后,BoAKR1、BoAKR2這2條基因表達(dá)量都顯著提高,且都在小菜蛾取食10 h后迅速增加,并達(dá)到最大值,表明BoAKR1、BoAKR2基因與小菜蛾取食脅迫相關(guān)；在受機械損傷后,BoAKR1、 BoAKR2基因表達(dá)量立即顯著上升,且BoAKR2基因表達(dá)量在受機械損傷0h表達(dá)量最高,而BoAKR1則是在受機械損傷4h后達(dá)到最大值,這表明BoAKR1、 BoAKR2基因與甘藍(lán)對機械損傷的應(yīng)急反應(yīng)相關(guān),且BoAKR2基因的相關(guān)性更密切；BoAKR3、BoAKR4基因表達(dá)量在甘藍(lán)受機械損傷后無顯著變化,但在受小菜蛾取食10h后這2條基因表達(dá)量顯著提高,表明BoAKR3、BoAKR4基因與甘藍(lán)受機械損傷無關(guān),但與小菜蛾取食脅迫相關(guān)；無論甘藍(lán)是受小菜蛾取食還是受機械損傷,BoAKR5基因表達(dá)量都無顯著變化,表明BoAKR5基因與小菜蛾取食脅迫以及機械損傷脅迫無關(guān)。同時,本研究將BoAKR1轉(zhuǎn)入含有CaMV35S啟動子的pCAMBIA1301載體中,構(gòu)建了pCAMBIA 1301+BoAKRI植物過表達(dá)載體,并成功將該植物表達(dá)載體導(dǎo)入甘藍(lán)植株中；將BoAKR1正反向基因序列與pJM007克隆載體相連,構(gòu)建重組質(zhì)粒pJM007+RNAi (BoAKR1),再將含有啟動子+BoAKR1(-)+intron+BoA KR1(+)+終止子元件從pJM007+RNAi(BoAKR1)重組質(zhì)粒中切下,并與植物表達(dá)載體pCAMBIA 1301連接,形成pCAMBIA 1301+RNAi (BoAKR1)植物RNAi抑制表達(dá)載體；設(shè)計針對BoAKR1基因的gRN A靶點序列,構(gòu)建CRISPR/Cas9植物表達(dá)載體。比較5種的NaClO消毒濃度下甘藍(lán)種子污染率,結(jié)果顯示種子污染率大小為4%NaClo 6% NaCIO 8% NaCIO 10% NaClO-12% NaClO,確定甘藍(lán)種子消毒最佳NaClO濃度為10%；對比6種愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基,配方為MS+3.0 mg/L 6-BA+0.45 mg/L NAA+3%蔗糖+0.7%瓊脂粉中的甘藍(lán)外植體第7d開始形成愈傷組織,在第20d,40個外植體中共有26個形成愈傷組織,這在6種愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中表現(xiàn)最好。本研究為進一步研究甘藍(lán)醛酮還原酶基因在甘藍(lán)與小菜蛾互作中的作用提供基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：甘藍(lán)醛酮還原酶 小菜蛾 脅迫 愈傷誘導(dǎo) 載體構(gòu)建
【學(xué)位授予單位】：福建農(nóng)林大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S433.4
【目錄】：

• 摘要7-9
• Abstract9-11
• 1 前言11-17
• 1.1 抗蟲基因研究11-13
• 1.1.1 源于植物的抗蟲基因11-12
• 1.1.2 源于微生物的抗蟲基因12
• 1.1.3 源于動物的抗蟲基因12-13
• 1.2 醛酮還原酶13-15
• 1.3 本研究的目的和意義15-17
• 2 材料和方法17-39
• 2.1 材料和儀器17-19
• 2.1.1 供試蔬菜17
• 2.1.2 菌種和載體17
• 2.1.3 試劑與酶類17
• 2.1.4 試劑及溶液17-19
• 2.1.5 主要儀器19
• 2.2 不同處理條件下甘藍(lán)醛酮還原酶表達(dá)量的檢測19-22
• 2.2.1 甘藍(lán)總RNA提取19-20
• 2.2.2 甘藍(lán)總RNA第一鏈cDNA的合成20-21
• 2.2.3 甘藍(lán)醛酮還原酶表達(dá)量檢測21-22
• 2.3 植物表達(dá)載體構(gòu)建及農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化22-35
• 2.3.1 克隆載體構(gòu)建22-35
• 2.3.2 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化35
• 2.4 甘藍(lán)再生系統(tǒng)的建立35-38
• 2.4.1 甘藍(lán)種子消毒35
• 2.4.2 培養(yǎng)基35-36
• 2.4.3 外植體的選擇及培養(yǎng)36
• 2.4.4 甘藍(lán)遺傳轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)化植株的獲得36-38
• 2.5 轉(zhuǎn)基因植株的鑒定38-39
• 3 結(jié)果與分析39-51
• 3.1 BoAKR1～BoAKR5基因序列特征39
• 3.2 小菜蛾取食對甘藍(lán)醛酮還原酶表達(dá)量的影響39-45
• 3.3 植物表達(dá)載體構(gòu)建45-48
• 3.3.1 BoAKR1過表達(dá)載體構(gòu)建45-46
• 3.3.2 BoAKR1抑制表達(dá)載體構(gòu)建46-47
• 3.3.3 CRISPR/Cas9植物表達(dá)載體構(gòu)建47-48
• 3.4 轉(zhuǎn)基因甘藍(lán)48-51
• 3.4.1 甘藍(lán)組培配方篩選48-50
• 3.4.2 轉(zhuǎn)基因甘藍(lán)植株構(gòu)建與鑒定50-51
• 4 討論51-54
• 參考文獻(xiàn)54-61
• 附錄61-70
• 致謝70

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1 屠書泱;孫海丹;夏季;李娜;婁曉敏;舒紹坤;趙康;徐寧志;劉斯奇;;兩種醛酮還原酶(AKR1C12和AKR1C13)在小鼠組織中的分布[A];中國蛋白質(zhì)組學(xué)第三屆學(xué)術(shù)大會論文摘要[C];2005年

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2 龔文麗;甘藍(lán)醛酮還原酶基因?qū)π〔硕隇楹Φ捻憫?yīng)及其轉(zhuǎn)基因植株的構(gòu)建[D];福建農(nóng)林大學(xué);2016年

3 呂丹青;重組嗜熱醛酮還原酶的表達(dá)及性質(zhì)研究[D];浙江工業(yè)大學(xué);2011年

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7 劉旭;基于結(jié)構(gòu)解析的醛酮還原酶AKR5C3的底物選擇性研究[D];華東理工大學(xué);2011年

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本文編號：615230