本文關(guān)鍵詞：轉(zhuǎn)IRT1基因龍葵毛狀根體系的建立及其對鎘脅迫響應(yīng)的初步探討

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【摘要】：目的：自然界中存在能夠富集鎘(Cd)的超富集植物,這種植物可以通過新陳代謝機(jī)制攝取和固定環(huán)境中的Cd,從而在一定限度的Cd污染環(huán)境中得以生存。但目前已知的Cd超富集植物普遍存在富集量有限和富集系數(shù)低等缺點(diǎn),影響了推廣和應(yīng)用。隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展,通過基因工程的手段對Cd超富集植物進(jìn)行基因改造,是實(shí)現(xiàn)Cd污染環(huán)境植物修復(fù)實(shí)際應(yīng)用的有效方法。本研究選擇了分布廣泛、易獲得的Cd超富集植物龍葵(Solanum nigrum L.)進(jìn)行轉(zhuǎn)基因改造研究,利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法建立轉(zhuǎn)IRT1基因的龍葵毛狀根體系,對轉(zhuǎn)IRTl龍葵毛狀根富集Cd的效果和可能的機(jī)制進(jìn)行探討,希望為轉(zhuǎn)IRT1龍葵植株的再生和應(yīng)用提供可靠的理論基礎(chǔ)。方法：論文首先選取龍葵、油菜、芥菜3種Cd超富集植物進(jìn)行毛狀根的誘導(dǎo),通過對3種植物毛狀根組織富集Cd的能力和機(jī)制的初步研究,確定進(jìn)行轉(zhuǎn)基因改造的目標(biāo)植物為龍葵。然后對龍葵毛狀根的誘導(dǎo)條件進(jìn)行進(jìn)一步的優(yōu)化,考查不同發(fā)根農(nóng)桿菌菌種、預(yù)培養(yǎng)時(shí)激素萘乙酸(NAA)濃度、不同的外植體來源、不同的外植體類型對龍葵毛狀根誘導(dǎo)的影響。在對龍葵毛狀根誘導(dǎo)條件進(jìn)行優(yōu)化的基礎(chǔ)上,利用Takara公司的pRll0.7質(zhì)粒將與Cd富集相關(guān)的IRT1基因整合進(jìn)入發(fā)根農(nóng)桿菌ATCC15834中,并利用改造過的轉(zhuǎn)IRT1-ATCC15834菌液侵染龍葵葉片外植體,誘導(dǎo)獲得轉(zhuǎn)IRT1基因毛狀根。建立起穩(wěn)定的轉(zhuǎn)IRT1龍葵毛狀根液體懸浮培養(yǎng)體系后,利用PCR技術(shù)進(jìn)行IRT1基因、rolB基因的檢驗(yàn),確定IRT1基因、rolB基因已經(jīng)整合到植物毛狀根組織的DNA中；利用Western blot技術(shù)進(jìn)行目的蛋白的檢驗(yàn),確定IRT1基因的蛋白表達(dá)情況。最后對轉(zhuǎn)IRT1基因毛狀根進(jìn)行Cd富集實(shí)驗(yàn)研究。將轉(zhuǎn)IRT1龍葵毛狀根與野生型龍葵毛狀根分別置于含不同濃度Cd的培養(yǎng)液中進(jìn)行暗培養(yǎng)。14 d后取樣進(jìn)行毛狀根生長狀態(tài)、生物量、Cd含量、ROS(活性氧,Reactive Oxygen Species)積累情況、細(xì)胞凋亡情況、抗氧化酶系統(tǒng)活性、IRT1蛋白表達(dá)情況的分析和比較,探討轉(zhuǎn)入IRT1基因?qū)μ岣啐埧珷罡褪蹸d能力的影響。結(jié)果：根據(jù)龍葵、油菜和芥菜三種植物的毛狀根誘導(dǎo)生根率、毛狀根液體懸浮培養(yǎng)體系建立后毛狀根的生長狀況、毛狀根組織富集Cd能力的比較,發(fā)現(xiàn)龍葵毛狀根生物量大、富集Cd的能力較好,在Cd濃度為100μmol/L的條件下培養(yǎng)14 d后鮮重可達(dá)2.897 g,毛狀根中的Cd含量可達(dá)745.023μg/g,是適合用于進(jìn)一步進(jìn)行轉(zhuǎn)基因改造的目標(biāo)植物。對龍葵毛狀根誘導(dǎo)條件優(yōu)化的結(jié)果表明,利用發(fā)根農(nóng)桿菌ATCC15834侵染生長3周的龍葵無菌苗外植體葉片(預(yù)培養(yǎng)NAA濃度為0.6mg/L),毛狀根的誘導(dǎo)效果最好,此條件下生根率達(dá)90%以上。利用含IRT1基因的重組菌ATCC15834侵染龍葵葉片外植體獲得了轉(zhuǎn)IRT1龍葵毛狀根,rol B、IRT1基因的PCR檢測結(jié)果表明毛狀根DNA中存在423 bp、1044bp大小條帶,證明rol B基因、IRT1基因已經(jīng)整合進(jìn)入龍葵毛狀根組織。Western blot技術(shù)檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)IRT1基因目的蛋白已有表達(dá)。Cd脅迫實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,在無Cd處理的對照條件下,轉(zhuǎn)IRTl龍葵毛狀根與未轉(zhuǎn)入IRTl的野生型龍葵毛狀根在各方面評價(jià)指標(biāo)中均無明顯差異；隨著培養(yǎng)液中Cd濃度的升高,野生型和轉(zhuǎn)IRTl龍葵毛狀根都能有效地耐受高濃度Cd的脅迫作用,但轉(zhuǎn)IRT1龍葵毛狀根的耐受能力優(yōu)于野生龍葵毛狀根。在不同Cd濃度下,轉(zhuǎn)IRTl龍葵毛狀根與野生型龍葵毛狀根相比,褐化程度都較小,生長狀態(tài)更好。在含100 μmol/LCd的培養(yǎng)液中培養(yǎng)14 d后,與未經(jīng)Cd處理的對照組毛狀根相比,野生型龍葵毛狀根鮮重減少了26.2%,干重減少了18.0%；而轉(zhuǎn)IRT1龍葵毛狀根在含100μmol/LCd的培養(yǎng)液中培養(yǎng)14 d后,與未經(jīng)Cd處理的轉(zhuǎn)IRTl龍葵毛狀根相比鮮重僅減少了6.0%,干重減少了2.5%,對比可知,轉(zhuǎn)入IRTl基因的龍葵毛狀根生物量受Cd毒害作用的影響較小。從Cd的富集量來看,在Cd濃度為100gmol/L的條件下,轉(zhuǎn)IRT1龍葵毛狀根和野生型龍葵毛狀根中Cd的富集量分別為886.759 gg/g和745.023μg/g,表明轉(zhuǎn)IRT1龍葵毛狀根表現(xiàn)出更優(yōu)的Cd富集效果。并且在Cd脅迫下,轉(zhuǎn)IRT1龍葵毛狀根比野生型龍葵毛狀根的抗氧化酶活性(CAT、SOD、POD)更強(qiáng),IRT1蛋白表達(dá)量高；而ROS積累程度和細(xì)胞凋亡程度比野生型毛狀根小,說明轉(zhuǎn)IRT1龍葵毛狀根比野生型龍葵毛狀根細(xì)胞受損傷的程度小。上述結(jié)果表明IRT1基因的轉(zhuǎn)入較好地提高了龍葵毛狀根對Cd的耐受能力,實(shí)現(xiàn)了對龍葵毛狀根的轉(zhuǎn)基因改造目標(biāo)。論文建立的轉(zhuǎn)基因自主生長毛狀根體系可作為重金屬吸附機(jī)理研究的可靠實(shí)驗(yàn)體系,研究結(jié)果為將來獲得轉(zhuǎn)IRT1基因龍葵再生植株提供了一定的應(yīng)用理論基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：鎘超富集植物 龍葵 毛狀根 發(fā)根農(nóng)桿菌 IRT1 發(fā)根農(nóng)桿菌 芥菜 油菜
【學(xué)位授予單位】：北京交通大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：Q945.78
【目錄】：

• 致謝5-6
• 中文摘要6-8
• ABSTRACT8-14
• 1 引言14-20
• 1.1 重金屬鎘(Cd)超富集植物研究現(xiàn)狀14-15
• 1.1.1 重金屬Cd污染土壤修復(fù)研究的進(jìn)展14
• 1.1.2 現(xiàn)有重金屬Cd超富集植物開發(fā)及研究現(xiàn)狀14-15
• 1.1.3 龍葵應(yīng)用于Cd污染土壤修復(fù)的優(yōu)勢15
• 1.2 重金屬Cd超富集植物的轉(zhuǎn)基因改造進(jìn)展15-17
• 1.2.1 植物富集Cd的分子機(jī)制16
• 1.2.2 重金屬Cd超富集植物轉(zhuǎn)基因改造現(xiàn)狀16-17
• 1.3 毛狀根組織在植物修復(fù)研究中的應(yīng)用17-19
• 1.3.1 重金屬超富集植物的轉(zhuǎn)基因改造研究方法17-18
• 1.3.2 毛狀根的特性及應(yīng)用于植物修復(fù)中的優(yōu)勢18-19
• 1.4 本實(shí)驗(yàn)的研究目的和意義19-20
• 1.4.1 目的19
• 1.4.2 意義19-20
• 2 實(shí)驗(yàn)材料和方法20-43
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料20-24
• 2.1.1 生物材料20
• 2.1.2 試劑、耗材、主要儀器20-22
• 2.1.2.1 試劑及儀器采購廠家20-21
• 2.1.2.2 儀器信息21-22
• 2.1.3 試劑的配制22-24
• 2.1.3.1 培養(yǎng)基的配制22-23
• 2.1.3.2 緩沖液的配制23-24
• 2.1.3.3 抗生素的配制24
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法24-43
• 2.2.1 菌種的活化及保存24-26
• 2.2.2 Cd超富集植物毛狀根誘導(dǎo)的摸索及目標(biāo)Cd超富集植物的選擇26
• 2.2.3 毛狀根的誘導(dǎo)26-27
• 2.2.4 毛狀根誘導(dǎo)條件的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)27-28
• 2.2.5 毛狀根基因組的提取和PCR檢測28-29
• 2.2.6 三種植物Cd富集實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)29-33
• 2.2.7 龍葵毛狀根生長曲線的測定33
• 2.2.8 IRT1編碼基因的合成33-34
• 2.2.9 重組質(zhì)粒pRI101-IRT1的獲得34-37
• 2.2.10 轉(zhuǎn)基因發(fā)根農(nóng)桿菌的獲得和菌種保藏37-38
• 2.2.11 轉(zhuǎn)基因發(fā)根農(nóng)桿菌的PCR檢測38
• 2.2.12 轉(zhuǎn)IRT1龍葵毛狀根的獲得及鑒定38
• 2.2.13 轉(zhuǎn)IRT1龍葵毛狀根總蛋白的提取和Western blot檢測分析38-41
• 2.2.14 龍葵毛狀根Cd脅迫響應(yīng)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)41-42
• 2.2.15 數(shù)據(jù)整理和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析42-43
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論43-72
• 3.1 三種Cd超富集植物毛狀根誘導(dǎo)的比較及轉(zhuǎn)基因改造目標(biāo)植物龍葵的確定43-58
• 3.1.1 發(fā)根農(nóng)桿菌菌種對不同植物外植體生根誘導(dǎo)的影響43-45
• 3.1.2 三種Cd超富集植物毛狀根的PCR檢驗(yàn)及rolB基因鑒定45-46
• 3.1.3 最佳誘導(dǎo)條件下三種Cd超富集植物生根效果的比較46
• 3.1.4 三種Cd超富集植物毛狀根富集Cd能力的分析46-54
• 3.1.4.1 Cd處理后三種植物毛狀根生長狀態(tài)的比較46-48
• 3.1.4.2 Cd處理后三種植物毛狀根生物量的比較48-49
• 3.1.4.3 三種植物毛狀根富集Cd含量的比較49
• 3.1.4.4 Cd處理對三種植物毛狀根細(xì)胞損傷程度的比較49-51
• 3.1.4.5 Cd處理對三種植物毛狀根抗氧化還原酶系統(tǒng)活性的變化比較51-54
• 3.1.5. 轉(zhuǎn)基因改造目標(biāo)植物龍葵的確定54
• 3.1.6 轉(zhuǎn)基因改造目標(biāo)植物龍葵毛狀根誘導(dǎo)條件的進(jìn)一步優(yōu)化54-57
• 3.1.6.1 不同激素濃度對不同的龍葵外植體生根誘導(dǎo)的影響54-55
• 3.1.6.2 不同來源的材料誘導(dǎo)龍葵毛狀根的差異55-56
• 3.1.6.3 龍葵毛狀根液體培養(yǎng)體系的建立56-57
• 3.1.7 龍葵毛狀根生長曲線的測定57-58
• 3.1.8 小結(jié)58
• 3.2 pRI101-IRT1載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)IRE1龍葵毛狀根體系的建立58-62
• 3.2.1 質(zhì)粒pUC57、pRI101的雙酶切鑒定58
• 3.2.2 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化結(jié)果分析58-60
• 3.2.3 轉(zhuǎn)基因發(fā)根農(nóng)桿菌中IRT1基因的PCR鑒定60
• 3.2.4 轉(zhuǎn)IRT1龍葵毛狀根和對照組毛狀根的形態(tài)比較60
• 3.2.5 轉(zhuǎn)IRT1龍葵毛狀根DNA中IRT1基因的PCR結(jié)果60-62
• 3.2.6 轉(zhuǎn)IRT1龍葵毛狀根DNA的測序結(jié)果62
• 3.2.7 轉(zhuǎn)IRT1龍葵毛狀根目的蛋白表達(dá)結(jié)果62
• 3.2.8 小結(jié)62
• 3.3 轉(zhuǎn)IRT1龍葵毛狀根對Cd脅迫響應(yīng)的初步探討62-72
• 3.3.1 Cd處理下轉(zhuǎn)IRT1龍葵毛狀根和對照組毛狀根生長狀況的對比62-64
• 3.3.2 Cd處理對轉(zhuǎn)IRT1龍葵毛狀根和對照組龍葵毛狀根生物量的影響64-65
• 3.3.3 轉(zhuǎn)IRT1-龍葵毛狀根和對照組毛狀根富集Cd效果的比較65
• 3.3.4 Cd處理下轉(zhuǎn)IRT1龍葵毛狀根和對照組毛狀根中ROS的積累和細(xì)胞損傷程度的比較65-68
• 3.3.5 Cd處理對轉(zhuǎn)IRT1龍葵毛狀根和對照組毛狀根抗氧化還原酶系統(tǒng)(SOD、POD、CAT)活性的變化比較68-70
• 3.3.6 Cd處理對轉(zhuǎn)基因龍葵毛狀根中IRT1蛋白表達(dá)的分析和比較70-71
• 3.3.7 小結(jié)71-72
• 4 結(jié)論72-74
• 參考文獻(xiàn)74-78
• 作者簡歷及攻讀碩士學(xué)位期間取得的研究成果78-80
• 學(xué)位論文數(shù)據(jù)集80

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