本文關(guān)鍵詞：FOXO1基因參與調(diào)控人肝癌細(xì)胞胰島素抵抗的研究

  更多相關(guān)文章： FOXO1 胰島素抵抗 吡格列酮 人源肝癌細(xì)胞HepG2 2型糖尿病

【摘要】：目的:本實(shí)驗(yàn)選用人源肝癌細(xì)胞Hep G2細(xì)胞株,通過高濃度胰島素誘導(dǎo)Hep G2細(xì)胞建立Hep G2胰島素抵抗模型,分析不同濃度胰島素條件下Hep G2肝細(xì)胞對(duì)糖原消耗量,確定胰島素誘導(dǎo)的最佳誘導(dǎo)濃度和時(shí)間,檢測(cè)在不同濃度和時(shí)間的胰島素干預(yù)下,Hep G2肝細(xì)胞中FOXO1基因的表達(dá)差異以及FOXO1蛋白的表達(dá)差異,進(jìn)而得出研究FOXO1基因是否參與調(diào)控肝癌細(xì)胞胰島素抵抗。并且利用胰島素增敏藥物吡格列酮降低Hep G2細(xì)胞胰島素抵抗程度,再次檢測(cè)Hep G2肝細(xì)胞中FOXO1基因的表達(dá)差異以及FOXO1蛋白的表達(dá)差異,反面驗(yàn)證FOXO1基因是否直接調(diào)控參與調(diào)控肝癌細(xì)胞胰島素抵抗。方法:培養(yǎng)人肝癌細(xì)胞(Hep G2),當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)超過培養(yǎng)瓶底面85%以上面積,進(jìn)行傳代,以密度為1×105/ml分為6組,將細(xì)胞均勻的種植于96孔板中,待細(xì)胞貼壁后,去除培養(yǎng)液中血清成分進(jìn)行培養(yǎng)即為同步化24小時(shí)后,對(duì)每組細(xì)胞使用不同濃度胰島素進(jìn)行干預(yù),胰島素濃度分別為1×10-5,1×10-6,1×10-7,1×10-8,1×10-9,1×10-10(單位mol/L)。干預(yù)24小時(shí)后,使用葡萄糖氧化酶-過氧化物酶法檢測(cè)各組細(xì)胞培養(yǎng)中葡萄糖含量,用MTT檢測(cè)每孔細(xì)胞含量,標(biāo)化細(xì)胞糖原消耗量,分析最佳濃度。重新將細(xì)胞以密度為1×105/ml分為3組,接種于96孔板,待細(xì)胞貼壁后,進(jìn)行無血清培養(yǎng)即為同步化24小時(shí)后,對(duì)每組細(xì)胞使用最佳濃度胰島素進(jìn)行干預(yù),對(duì)每組細(xì)胞分別采用不同時(shí)間進(jìn)行誘導(dǎo),分別為24h,36h,48h,使用葡萄糖氧化酶-過氧化物酶法檢測(cè)各組細(xì)胞中葡萄糖含量,MTT檢測(cè)每孔細(xì)胞含量,標(biāo)化細(xì)胞糖原消耗量。分析最佳時(shí)間。確定最佳時(shí)間,收集細(xì)胞,使用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)不同胰島素干預(yù)組FOXO1基因表達(dá),Western印跡法(WB)定量檢測(cè)各組細(xì)胞FOXO1蛋白表達(dá)水平,驗(yàn)證FOXO1與胰島素抵抗的相關(guān)性。用MTT法檢測(cè)吡格列酮對(duì)細(xì)胞凋亡的影響,選取影響較低的濃度,對(duì)最佳濃度,最佳時(shí)間的胰島素干預(yù)組,分別用不含吡格列酮的培養(yǎng)液和含不同濃度的吡格列酮培養(yǎng)液培養(yǎng)24h,使用葡萄糖氧化酶-過氧化物酶法檢測(cè)各組細(xì)胞中葡萄糖含量。選取最佳濃度的吡格列酮干預(yù)組,使用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)該組細(xì)胞FOXO1基因表達(dá),Western印跡法(WB)定量檢測(cè)各組細(xì)胞FOXO1蛋白表達(dá)水平,反向驗(yàn)證FOXO1與胰島素抵抗的相關(guān)性,闡明FOXO1基因參與調(diào)控人肝癌細(xì)胞的胰島素抵抗。結(jié)果:Hep G2細(xì)胞胰島素抵抗模型的最佳誘導(dǎo)條件為10-7mol/L胰島素處理36小時(shí),胰島素抵抗逆轉(zhuǎn)模型誘導(dǎo)的最佳濃度為1.25mmol/L鹽酸吡咯列酮處理24小時(shí),細(xì)胞發(fā)生胰島素抵抗時(shí)Fox O1基因與蛋白的表達(dá)均顯著偏高,而發(fā)生胰島素抵抗逆轉(zhuǎn)時(shí),Fox O1的表達(dá)則接近對(duì)照組水平。結(jié)論在體外誘導(dǎo)建立的胰島素抵抗模型和胰島素抵抗逆轉(zhuǎn)模型中,細(xì)胞對(duì)胰島素的敏感性與Fox O1基因的表達(dá)呈負(fù)相關(guān),提示Fox O1有可能作為胰島素增敏劑的藥物篩選靶標(biāo)及藥效評(píng)估指標(biāo)。
【關(guān)鍵詞】：FOXO1 胰島素抵抗 吡格列酮 人源肝癌細(xì)胞HepG2 2型糖尿病
【學(xué)位授予單位】：蘭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R587.2;R781
【目錄】：

• 中文摘要3-5
• 英文摘要5-9
• 第一章 前言9-16
• 1.1 研究背景9
• 1.2 糖尿病簡(jiǎn)介9-10
• 1.2.1 糖尿病分類9-10
• 1.3 胰島素10-12
• 1.3.1 胰島素的產(chǎn)生及功能10-11
• 1.3.2 胰島素抵抗概念11
• 1.3.3 胰島素抵抗機(jī)理11-12
• 1.4 胰島素抵抗的逆轉(zhuǎn)12
• 1.5 Foxo112-16
• 1.5.1 Foxo1的結(jié)構(gòu)和人體類的分布12-13
• 1.5.2 Foxo1在糖代謝中的作用13
• 1.5.3 Foxo1與糖尿病的關(guān)系13-14
• 1.5.4 Foxo1與胰島素抵抗14
• 1.5.5 Foxo1與口腔疾病的關(guān)系14-16
• 第二章 材料和方法16-24
• 2.1 儀器與試劑16-17
• 2.1.1 主要儀器16
• 2.1.2 主要試劑16-17
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法17-20
• 2.2.0 溶液配制17-19
• 2.2.1 細(xì)胞復(fù)蘇19
• 2.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)19
• 2.2.3 胰島素抵抗細(xì)胞的誘導(dǎo)與建立19-20
• 2.3 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR法檢測(cè)FOXO1基因表達(dá)20-21
• 2.3.1 總RNA提取20-21
• 2.3.2 cDNA制備21
• 2.3.3 熒光定量PCR21
• 2.4 Western Blotting法檢測(cè)蛋白質(zhì)表達(dá)21-22
• 2.4.1 蛋白質(zhì)的抽取及定量21
• 2.4.2 SDS-PAGE電泳21-22
• 2.4.3 轉(zhuǎn)膜22
• 2.4.4 免疫反應(yīng)22
• 2.5 糖原染色22-24
• 2.5.1 細(xì)胞爬片及干預(yù)處理22-23
• 2.5.2 細(xì)胞染色23
• 2.5.3 觀察拍照23-24
• 第三章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果24-34
• 3.1 不同濃度胰島素作用不同時(shí)間對(duì)HepG2細(xì)胞葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)消耗量的影響24-29
• 3.2 不同濃度鹽酸吡格列酮對(duì)胰島素抵抗逆轉(zhuǎn)后細(xì)胞存活率的影響29
• 3.3 各組細(xì)胞FoxO1基因的表達(dá)29-31
• 3.4 各組細(xì)胞FoxO1蛋白的表達(dá)31-32
• 3.5 糖原檢測(cè)半定量結(jié)果32-34
• 第四章 討論34-39
• 參考文獻(xiàn)39-43
• 致謝43

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 尚偉華;邱霞;鄢尚民;;糖尿病與牙周病的影響機(jī)制研究進(jìn)展[J];中國(guó)療養(yǎng)醫(yī)學(xué);2014年09期

2 趙晶蕾;江凌勇;毛麗霞;劉加強(qiáng);房兵;;人牙周膜干細(xì)胞成骨相誘導(dǎo)后相關(guān)基因的表達(dá)變化[J];上�？谇会t(yī)學(xué);2014年04期

3 周園媛;王戰(zhàn)建;;FoxO1與糖尿病的關(guān)系[J];中華臨床醫(yī)師雜志(電子版);2013年16期

4 李秀麗;賀嵩敏;朱瑩;馮兵;黃小千;陳婷;鄭廣娟;;HepG2細(xì)胞胰島素抵抗模型的建立與鑒定[J];中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志;2013年05期

5 董正謀;劉魯川;;牙周膜干細(xì)胞的研究進(jìn)展[J];國(guó)際口腔醫(yī)學(xué)雜志;2012年04期

6 黃寧;李文佳;安利國(guó);楊桂文;;FoxO1的功能及其與人類疾病的關(guān)系[J];生命科學(xué);2012年04期

7 楊國(guó)慶;母義明;;2型糖尿病胰島素起始治療——中國(guó)2型糖尿病防治指南(2010年版)解讀[J];中國(guó)醫(yī)學(xué)前沿雜志(電子版);2012年03期

8 沈小波;任漢強(qiáng);萬(wàn)歡;龔傳明;;轉(zhuǎn)錄因子FOXO1對(duì)胰島β細(xì)胞致炎因子產(chǎn)生的影響[J];免疫學(xué)雜志;2011年05期

9 李蘭芳;陳臨溪;郭玉;唐國(guó)濤;喻翠云;;吡格列酮改善高脂飲食導(dǎo)致的大鼠肝臟胰島素抵抗[J];中國(guó)臨床藥理學(xué)與治療學(xué);2010年12期

10 王林;楊振宇;;手術(shù)切口感染的原因及預(yù)防[J];基層醫(yī)學(xué)論壇;2010年31期

中國(guó)博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前4條

1 續(xù)繁星;FOXO1及牙周病致病菌影響口腔黏膜愈合機(jī)制[D];大連理工大學(xué);2014年

2 謝偉東;犬糖尿病發(fā)病情況調(diào)查與臨床診療研究[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2013年

3 焦娟;蛋白磷酸酶4在IL-6誘導(dǎo)的肝臟胰島素抵抗中的作用機(jī)制研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2012年

4 高丹;NADPH氧化酶3源性活性氧在游離脂肪酸誘導(dǎo)的肝臟胰島素抵抗發(fā)生中的作用機(jī)理研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2009年

中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 宮翠紅;電針聯(lián)合黃芪多糖對(duì)db/db小鼠血糖及胰島β細(xì)胞功能影響的實(shí)驗(yàn)研究[D];南京中醫(yī)藥大學(xué);2012年

，

本文編號(hào)：598672