本文關鍵詞：FOXO1基因參與調(diào)控人肝癌細胞胰島素抵抗的研究

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【摘要】：目的:本實驗選用人源肝癌細胞Hep G2細胞株,通過高濃度胰島素誘導Hep G2細胞建立Hep G2胰島素抵抗模型,分析不同濃度胰島素條件下Hep G2肝細胞對糖原消耗量,確定胰島素誘導的最佳誘導濃度和時間,檢測在不同濃度和時間的胰島素干預下,Hep G2肝細胞中FOXO1基因的表達差異以及FOXO1蛋白的表達差異,進而得出研究FOXO1基因是否參與調(diào)控肝癌細胞胰島素抵抗。并且利用胰島素增敏藥物吡格列酮降低Hep G2細胞胰島素抵抗程度,再次檢測Hep G2肝細胞中FOXO1基因的表達差異以及FOXO1蛋白的表達差異,反面驗證FOXO1基因是否直接調(diào)控參與調(diào)控肝癌細胞胰島素抵抗。方法:培養(yǎng)人肝癌細胞(Hep G2),當細胞生長超過培養(yǎng)瓶底面85%以上面積,進行傳代,以密度為1×105/ml分為6組,將細胞均勻的種植于96孔板中,待細胞貼壁后,去除培養(yǎng)液中血清成分進行培養(yǎng)即為同步化24小時后,對每組細胞使用不同濃度胰島素進行干預,胰島素濃度分別為1×10-5,1×10-6,1×10-7,1×10-8,1×10-9,1×10-10(單位mol/L)。干預24小時后,使用葡萄糖氧化酶-過氧化物酶法檢測各組細胞培養(yǎng)中葡萄糖含量,用MTT檢測每孔細胞含量,標化細胞糖原消耗量,分析最佳濃度。重新將細胞以密度為1×105/ml分為3組,接種于96孔板,待細胞貼壁后,進行無血清培養(yǎng)即為同步化24小時后,對每組細胞使用最佳濃度胰島素進行干預,對每組細胞分別采用不同時間進行誘導,分別為24h,36h,48h,使用葡萄糖氧化酶-過氧化物酶法檢測各組細胞中葡萄糖含量,MTT檢測每孔細胞含量,標化細胞糖原消耗量。分析最佳時間。確定最佳時間,收集細胞,使用RT-PCR技術檢測不同胰島素干預組FOXO1基因表達,Western印跡法(WB)定量檢測各組細胞FOXO1蛋白表達水平,驗證FOXO1與胰島素抵抗的相關性。用MTT法檢測吡格列酮對細胞凋亡的影響,選取影響較低的濃度,對最佳濃度,最佳時間的胰島素干預組,分別用不含吡格列酮的培養(yǎng)液和含不同濃度的吡格列酮培養(yǎng)液培養(yǎng)24h,使用葡萄糖氧化酶-過氧化物酶法檢測各組細胞中葡萄糖含量。選取最佳濃度的吡格列酮干預組,使用RT-PCR技術檢測該組細胞FOXO1基因表達,Western印跡法(WB)定量檢測各組細胞FOXO1蛋白表達水平,反向驗證FOXO1與胰島素抵抗的相關性,闡明FOXO1基因參與調(diào)控人肝癌細胞的胰島素抵抗。結果:Hep G2細胞胰島素抵抗模型的最佳誘導條件為10-7mol/L胰島素處理36小時,胰島素抵抗逆轉模型誘導的最佳濃度為1.25mmol/L鹽酸吡咯列酮處理24小時,細胞發(fā)生胰島素抵抗時Fox O1基因與蛋白的表達均顯著偏高,而發(fā)生胰島素抵抗逆轉時,Fox O1的表達則接近對照組水平。結論在體外誘導建立的胰島素抵抗模型和胰島素抵抗逆轉模型中,細胞對胰島素的敏感性與Fox O1基因的表達呈負相關,提示Fox O1有可能作為胰島素增敏劑的藥物篩選靶標及藥效評估指標。
【關鍵詞】：FOXO1 胰島素抵抗 吡格列酮 人源肝癌細胞HepG2 2型糖尿病
【學位授予單位】：蘭州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R587.2;R781
【目錄】：

• 中文摘要3-5
• 英文摘要5-9
• 第一章 前言9-16
• 1.1 研究背景9
• 1.2 糖尿病簡介9-10
• 1.2.1 糖尿病分類9-10
• 1.3 胰島素10-12
• 1.3.1 胰島素的產(chǎn)生及功能10-11
• 1.3.2 胰島素抵抗概念11
• 1.3.3 胰島素抵抗機理11-12
• 1.4 胰島素抵抗的逆轉12
• 1.5 Foxo112-16
• 1.5.1 Foxo1的結構和人體類的分布12-13
• 1.5.2 Foxo1在糖代謝中的作用13
• 1.5.3 Foxo1與糖尿病的關系13-14
• 1.5.4 Foxo1與胰島素抵抗14
• 1.5.5 Foxo1與口腔疾病的關系14-16
• 第二章 材料和方法16-24
• 2.1 儀器與試劑16-17
• 2.1.1 主要儀器16
• 2.1.2 主要試劑16-17
• 2.2 實驗方法17-20
• 2.2.0 溶液配制17-19
• 2.2.1 細胞復蘇19
• 2.2.2 細胞培養(yǎng)19
• 2.2.3 胰島素抵抗細胞的誘導與建立19-20
• 2.3 實時熒光定量RT-PCR法檢測FOXO1基因表達20-21
• 2.3.1 總RNA提取20-21
• 2.3.2 cDNA制備21
• 2.3.3 熒光定量PCR21
• 2.4 Western Blotting法檢測蛋白質表達21-22
• 2.4.1 蛋白質的抽取及定量21
• 2.4.2 SDS-PAGE電泳21-22
• 2.4.3 轉膜22
• 2.4.4 免疫反應22
• 2.5 糖原染色22-24
• 2.5.1 細胞爬片及干預處理22-23
• 2.5.2 細胞染色23
• 2.5.3 觀察拍照23-24
• 第三章 實驗結果24-34
• 3.1 不同濃度胰島素作用不同時間對HepG2細胞葡萄糖標準消耗量的影響24-29
• 3.2 不同濃度鹽酸吡格列酮對胰島素抵抗逆轉后細胞存活率的影響29
• 3.3 各組細胞FoxO1基因的表達29-31
• 3.4 各組細胞FoxO1蛋白的表達31-32
• 3.5 糖原檢測半定量結果32-34
• 第四章 討論34-39
• 參考文獻39-43
• 致謝43

【參考文獻】

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本文編號：598672