發(fā)布時(shí)間：2017-07-30 14:22

  本文關(guān)鍵詞：骨髓瘤細(xì)胞株H929的SOX2蛋白及趨化相關(guān)基因CCR1、CCR2、MCP-1等轉(zhuǎn)錄受白介素-1β預(yù)處理的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞影響

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【摘要】：目的:觀察白介素(interleukin,IL)-1β單次或多次預(yù)處理人BMMSCs后,對(duì)BMMSCs的BMP-2表達(dá)的影響;以及不同方案預(yù)處理的BMMSCs與MM細(xì)胞株共培養(yǎng)后,觀察其對(duì)骨髓瘤細(xì)胞的干細(xì)胞相關(guān)蛋白、趨化細(xì)胞因子及其相關(guān)受體等表達(dá)的影響。方法:1、實(shí)驗(yàn)分三組:A組:為無(wú)IL-1β預(yù)處理的BMMSCs對(duì)照組、B組:為IL-1β預(yù)刺激1天、C組:IL-1β每天預(yù)刺激1次,共連續(xù)處理7天。三組分別加入骨髓瘤細(xì)胞株H929直接接觸共培養(yǎng),3天后收集各組中H929細(xì)胞。觀察各組細(xì)胞形態(tài)及生長(zhǎng)狀況。2、采用細(xì)胞免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)各組BMMSCs的BMP-2的表達(dá),同時(shí)加用NF-k B的抑制劑(Pyrrolidine dithiocarbamate,PDTC),研究NF-k B通路在BMMSCs的BMP-2表達(dá)的影響。3、采用Western blot方法檢測(cè)各組H929細(xì)胞NANOG、SOX2和OCT-4蛋白的表達(dá)水平。4、采用RT-PCR方法檢測(cè)各組H929細(xì)胞因子CCR1、CCR2、CCR6、CXCR4、MCP-1、MIP-1α和DKK1的表達(dá)水平。結(jié)果:1、倒置顯微鏡觀察示:各組BMMSCs均能在體外貼壁生長(zhǎng)。經(jīng)IL-1β預(yù)處理1 d和7 d后的BMMSCs,其形態(tài)與對(duì)照組均無(wú)明顯區(qū)別,均呈梭形。H929細(xì)胞呈懸浮生長(zhǎng),部分細(xì)胞可聚集成串珠樣葡萄狀。單獨(dú)培養(yǎng)與共培養(yǎng)的BMMSCs、H929細(xì)胞,形態(tài)上無(wú)明顯差別。2、細(xì)胞免疫組化結(jié)果顯示:與組A組比較,B組、C組BMMSCs的BMP-2表達(dá)增高;用NF-k B的抑制劑PDTC預(yù)處理后,實(shí)驗(yàn)組B、C兩組BMP-2表達(dá)水平明顯降低。3、Western blot結(jié)果顯示:與A組比較,H929細(xì)胞株和B組、C組共培養(yǎng)后,SOX2蛋白表達(dá)水平升高,且B組、C組SOX2蛋白表達(dá)水平的相對(duì)灰度值與A組間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05;n=5)。A、B、C三組間NANOG、OCT-4蛋白的表達(dá)均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。4、RT-PCR結(jié)果顯示:與A組、B組比較,H929細(xì)胞株和C組共培養(yǎng)后,CCR1、CCR2、MCP-1、MIP-1α基因的相對(duì)表達(dá)水平均增高,且其存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05;n=6)。但三組間CCR6、CXCR4、DKK1基因的相對(duì)表達(dá)量無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)論:我們的體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,IL-1β單次或多次刺激正常骨髓BMMSCs后,可增加BMMSCs的BMP-2表達(dá),并且BMP-2表達(dá)的上調(diào)能被NF-k B的抑制劑PDTC抑制;預(yù)處理的BMMSCs在與骨髓瘤細(xì)胞的相互作用中,對(duì)骨髓瘤細(xì)胞的干細(xì)胞基因表達(dá),細(xì)胞因子及其受體表達(dá)等均產(chǎn)生影響。這提示骨髓微環(huán)境中異常水平炎性因子,除了可直接作用于骨髓瘤細(xì)胞外,還可以通過(guò)調(diào)節(jié)BMMSCs的功能,在BMMSCs與骨髓瘤細(xì)胞相互作用后,間接參與骨髓瘤疾病的發(fā)生和發(fā)展;IL-1β其對(duì)骨髓瘤細(xì)胞的間接影響效果,與IL-1β作用BMMSCs的時(shí)間長(zhǎng)短有關(guān)。
【關(guān)鍵詞】：多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 骨髓微環(huán)境 IL-1β 干細(xì)胞基因
【學(xué)位授予單位】：江蘇大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R733.3
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-12
• 英文縮寫索引12-13
• 第一章 引言13-16
• 第二章 實(shí)驗(yàn)材料、方法和設(shè)計(jì)16-30
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料16-18
• 2.1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞16
• 2.1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑16-17
• 2.1.3 主要實(shí)驗(yàn)器材17-18
• 2.2 溶液的配制18-20
• 2.3 實(shí)驗(yàn)方法20-28
• 2.3.1 實(shí)驗(yàn)分組20
• 2.3.2 BMMSCs的體外分離和培養(yǎng)20-21
• 2.3.3 BMMSCs的傳代培養(yǎng)21
• 2.3.4 BMMSCs的凍存21-22
• 2.3.5 BMMSCs的復(fù)蘇22
• 2.3.6 免疫組化法細(xì)胞的準(zhǔn)備22
• 2.3.7 H929細(xì)胞的復(fù)蘇22-23
• 2.3.8 H929細(xì)胞的培養(yǎng)23
• 2.3.9 H929細(xì)胞的凍存23
• 2.3.10 BMMSCs與H929細(xì)胞共培養(yǎng)23
• 2.3.11 H929細(xì)胞總蛋白的提取23-24
• 2.3.12 蛋白印跡法24-25
• 2.3.13 BMMSCs免疫組化化學(xué)染色25-26
• 2.3.14 H929細(xì)胞總RNA提取26-27
• 2.3.15 RNA逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)27
• 2.3.16 實(shí)驗(yàn)所用引物27-28
• 2.3.17 實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)28
• 2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理28-29
• 2.5 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案29-30
• 第三章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果30-37
• 3.1 BMMSCs及H929細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察30-31
• 3.2 細(xì)胞免疫組化結(jié)果31-32
• 3.3 WESTERN BLOT結(jié)果32-33
• 3.4 RT-PCR檢測(cè)結(jié)果33-37
• 3.4.1 RNA結(jié)果33
• 3.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立33-35
• 3.4.3 RT-PCR結(jié)果35-37
• 第四章 討論37-43
• 第五章 結(jié)論43-44
• 參考文獻(xiàn)44-52
• 致謝52-53
• 綜述53-64
• 參考文獻(xiàn)59-64
• 在讀學(xué)位期間發(fā)表的論文64

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