本文關鍵詞：骨髓瘤細胞株H929的SOX2蛋白及趨化相關基因CCR1、CCR2、MCP-1等轉錄受白介素-1β預處理的骨髓間充質干細胞影響

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【摘要】：目的:觀察白介素(interleukin,IL)-1β單次或多次預處理人BMMSCs后,對BMMSCs的BMP-2表達的影響;以及不同方案預處理的BMMSCs與MM細胞株共培養(yǎng)后,觀察其對骨髓瘤細胞的干細胞相關蛋白、趨化細胞因子及其相關受體等表達的影響。方法:1、實驗分三組:A組:為無IL-1β預處理的BMMSCs對照組、B組:為IL-1β預刺激1天、C組:IL-1β每天預刺激1次,共連續(xù)處理7天。三組分別加入骨髓瘤細胞株H929直接接觸共培養(yǎng),3天后收集各組中H929細胞。觀察各組細胞形態(tài)及生長狀況。2、采用細胞免疫組織化學染色法檢測各組BMMSCs的BMP-2的表達,同時加用NF-k B的抑制劑(Pyrrolidine dithiocarbamate,PDTC),研究NF-k B通路在BMMSCs的BMP-2表達的影響。3、采用Western blot方法檢測各組H929細胞NANOG、SOX2和OCT-4蛋白的表達水平。4、采用RT-PCR方法檢測各組H929細胞因子CCR1、CCR2、CCR6、CXCR4、MCP-1、MIP-1α和DKK1的表達水平。結果:1、倒置顯微鏡觀察示:各組BMMSCs均能在體外貼壁生長。經IL-1β預處理1 d和7 d后的BMMSCs,其形態(tài)與對照組均無明顯區(qū)別,均呈梭形。H929細胞呈懸浮生長,部分細胞可聚集成串珠樣葡萄狀。單獨培養(yǎng)與共培養(yǎng)的BMMSCs、H929細胞,形態(tài)上無明顯差別。2、細胞免疫組化結果顯示:與組A組比較,B組、C組BMMSCs的BMP-2表達增高;用NF-k B的抑制劑PDTC預處理后,實驗組B、C兩組BMP-2表達水平明顯降低。3、Western blot結果顯示:與A組比較,H929細胞株和B組、C組共培養(yǎng)后,SOX2蛋白表達水平升高,且B組、C組SOX2蛋白表達水平的相對灰度值與A組間存在統(tǒng)計學差異(P0.05;n=5)。A、B、C三組間NANOG、OCT-4蛋白的表達均無統(tǒng)計學差異。4、RT-PCR結果顯示:與A組、B組比較,H929細胞株和C組共培養(yǎng)后,CCR1、CCR2、MCP-1、MIP-1α基因的相對表達水平均增高,且其存在統(tǒng)計學差異(P0.05;n=6)。但三組間CCR6、CXCR4、DKK1基因的相對表達量無統(tǒng)計學差異。結論:我們的體外實驗結果顯示,IL-1β單次或多次刺激正常骨髓BMMSCs后,可增加BMMSCs的BMP-2表達,并且BMP-2表達的上調能被NF-k B的抑制劑PDTC抑制;預處理的BMMSCs在與骨髓瘤細胞的相互作用中,對骨髓瘤細胞的干細胞基因表達,細胞因子及其受體表達等均產生影響。這提示骨髓微環(huán)境中異常水平炎性因子,除了可直接作用于骨髓瘤細胞外,還可以通過調節(jié)BMMSCs的功能,在BMMSCs與骨髓瘤細胞相互作用后,間接參與骨髓瘤疾病的發(fā)生和發(fā)展;IL-1β其對骨髓瘤細胞的間接影響效果,與IL-1β作用BMMSCs的時間長短有關。
【關鍵詞】：多發(fā)性骨髓瘤細胞 骨髓間充質干細胞 骨髓微環(huán)境 IL-1β 干細胞基因
【學位授予單位】：江蘇大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R733.3
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-12
• 英文縮寫索引12-13
• 第一章 引言13-16
• 第二章 實驗材料、方法和設計16-30
• 2.1 實驗材料16-18
• 2.1.1 實驗細胞16
• 2.1.2 主要實驗試劑16-17
• 2.1.3 主要實驗器材17-18
• 2.2 溶液的配制18-20
• 2.3 實驗方法20-28
• 2.3.1 實驗分組20
• 2.3.2 BMMSCs的體外分離和培養(yǎng)20-21
• 2.3.3 BMMSCs的傳代培養(yǎng)21
• 2.3.4 BMMSCs的凍存21-22
• 2.3.5 BMMSCs的復蘇22
• 2.3.6 免疫組化法細胞的準備22
• 2.3.7 H929細胞的復蘇22-23
• 2.3.8 H929細胞的培養(yǎng)23
• 2.3.9 H929細胞的凍存23
• 2.3.10 BMMSCs與H929細胞共培養(yǎng)23
• 2.3.11 H929細胞總蛋白的提取23-24
• 2.3.12 蛋白印跡法24-25
• 2.3.13 BMMSCs免疫組化化學染色25-26
• 2.3.14 H929細胞總RNA提取26-27
• 2.3.15 RNA逆轉錄反應27
• 2.3.16 實驗所用引物27-28
• 2.3.17 實時熒光定量PCR反應28
• 2.4 統(tǒng)計學處理28-29
• 2.5 實驗設計方案29-30
• 第三章 實驗結果30-37
• 3.1 BMMSCs及H929細胞形態(tài)學觀察30-31
• 3.2 細胞免疫組化結果31-32
• 3.3 WESTERN BLOT結果32-33
• 3.4 RT-PCR檢測結果33-37
• 3.4.1 RNA結果33
• 3.4.2 標準曲線的建立33-35
• 3.4.3 RT-PCR結果35-37
• 第四章 討論37-43
• 第五章 結論43-44
• 參考文獻44-52
• 致謝52-53
• 綜述53-64
• 參考文獻59-64
• 在讀學位期間發(fā)表的論文64

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本文編號：594646