本文關(guān)鍵詞：新型復(fù)合磁性金納米基因載體的制備及在結(jié)腸痛基因治療中的研究

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【摘要】：[研究背景]目前,結(jié)腸癌是我國(guó)最常見的消化道惡性腫瘤之一,年發(fā)病率高達(dá)59/10萬,五年生存率約為32%。尋找有效的預(yù)防控制和治療結(jié)腸癌的方法是當(dāng)務(wù)之急,目前基因治療是腫瘤治療的一個(gè)重要研究方向。受諸多因素影響,基因治療效果并不十分理想。一方面,引起腫瘤發(fā)生的機(jī)制非常復(fù)雜,難以確定特異性的靶向基因。 目前研究普遍認(rèn)為,細(xì)胞凋亡障礙是腫瘤發(fā)生的重要機(jī)制,誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡是成功治療腫瘤的關(guān)鍵因素之一。研究表明Bag-1基因是重要的腫瘤凋亡抑制基因,其突變是結(jié)腸癌發(fā)生的重要遺傳基礎(chǔ),也是各種因素導(dǎo)致結(jié)腸癌發(fā)生過程的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。因此,將Bag-1基因?yàn)榘谢?運(yùn)用小干擾RNA技術(shù)特異性阻斷Bag-1基因表達(dá),用于結(jié)腸癌的基因治療,可能獲得一種新的結(jié)腸癌治療的有效方法。另一方面,基因治療受到基因傳遞系統(tǒng)的限制,以病毒為主的基因載體存在較大安全隱患；而非病毒磁性納米基因載體具有低毒低免疫性,是具有巨大潛力的新型基因載體。通過制備新型有效的納米基因載體搭載特異性阻斷Bag-1基因RNAi重組質(zhì)粒,進(jìn)行體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究探討其對(duì)結(jié)腸癌治療的療效和機(jī)制,對(duì)進(jìn)一步明確結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制,建立一種新型有效的結(jié)腸癌基因治療方法具有重要的意義。[目的]制備一種新型復(fù)合磁性金納米基因載體,并研究其介導(dǎo)RNAi重組質(zhì)粒沉默Bag-1基因后對(duì)結(jié)腸癌的治療及作用機(jī)制。[方法]1.采用化學(xué)共沉淀法及分子表面修飾技術(shù)制備功能性復(fù)合磁性金納米微粒(PEG/Fe3O4@Au),檢測(cè)其表征特性,并對(duì)其作為基因載體的性能進(jìn)行測(cè)試。2.采用細(xì)菌培養(yǎng)的方法擴(kuò)增并提取Bag-1基因RNAi重組質(zhì)粒(pGPH1/GFP/ Neo-Bag-1-homo-825),將RNAi質(zhì)粒與磁性金納米微粒進(jìn)行孵育,制備出載基因磁性金納米細(xì)胞轉(zhuǎn)染體系。3.噻唑藍(lán)(MTT)法檢測(cè)磁性金納米微粒對(duì)不同結(jié)腸癌細(xì)胞系(LoVo, HCT116)及正常結(jié)腸組織細(xì)胞系(FHC)的毒性,并選取Lipofectamine 2000基因載體作為對(duì)照進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。4.載基因磁性金納米轉(zhuǎn)染LoVo細(xì)胞系,熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞轉(zhuǎn)染情況,流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率及細(xì)胞凋亡率；實(shí)時(shí)熒光定量PCR (RT-PCR)和蛋白免疫印跡(Western blot)法檢測(cè)LoVo細(xì)胞中Bag-1基因在mRNA和蛋白水平的改變。5.皮下注射細(xì)胞活性高的單純LoVo細(xì)胞構(gòu)建Balb c/nud裸鼠移植瘤模型,模型構(gòu)建成功后隨機(jī)分成五組,每三天分別對(duì)相應(yīng)組小鼠原位注射相同體積的生理鹽水,質(zhì)粒,磁性金納米,載基因磁性金納米和載基因磁性金納米(外加磁場(chǎng)組),并記錄各組腫瘤瘤體生長(zhǎng)大小。四周后處死小鼠分別取各組瘤體組織,每份瘤體組織分別用4%的多聚甲醛固定組織及液氮處理后-80℃條件下直接保存新鮮瘤體組織。6.HE染色法觀察不同組瘤體組織形態(tài)學(xué)改變；免疫組化(1HC)法檢測(cè)不同組瘤體組織中Bag-1基因及腫瘤相關(guān)C-myc, β-catenin基因的表達(dá)情況。7. RT-PCR和Western blot法檢測(cè)不同組瘤體組織中Bag-1基因及腫瘤相關(guān)C-myc, β-catenin基因在mRNA和蛋白水平的表達(dá)情況。[結(jié)果]1.制備功能性復(fù)合磁性金納米微粒(PEG/Fe3O4@Au)在透射下呈大小約100nm左右圓形顆粒,分布較均勻。激光光散射粒度分析儀檢測(cè)結(jié)果顯示納米微粒大小約為(95.38±7.16)nm, zeta電位為(35.03±3.12)mV,能夠裝載并釋放質(zhì)粒DNA。2.經(jīng)驗(yàn)證擴(kuò)增并提取出的質(zhì)粒為所構(gòu)建的Bag-1基因RNAi重組質(zhì)粒(pGPH1/GFP/Neo-Bag-1-homo-825),與磁性金納米微粒孵育后,制備出性質(zhì)較穩(wěn)定的載基因磁性金納米轉(zhuǎn)染體系,可用于細(xì)胞轉(zhuǎn)染。3.磁性金納米微粒對(duì)細(xì)胞系LoVo,HCT116及FHC細(xì)胞基本無毒性,其性質(zhì)與Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑相似,載質(zhì)粒磁性金納米微粒能較明顯地抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞的活性而對(duì)人正常結(jié)腸組織細(xì)胞活性無明顯影響。4.載基因磁性金納米微粒成功轉(zhuǎn)入LoVo細(xì)胞,導(dǎo)入的外源基因在細(xì)胞內(nèi)順利表達(dá)。流式細(xì)胞分析結(jié)果顯示,載基因磁性金納米微粒細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率約為22%。相比磁性金納米轉(zhuǎn)染組,質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組以及對(duì)照組相比,載基因磁性金納米轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞凋亡率明顯升高(P0.05),而其余三組間細(xì)胞凋亡率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。RT-PCR和Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示載基因磁性金納米實(shí)驗(yàn)組Bag-1基因在mRNA(P0.05)和蛋白水平(P0.05)的表達(dá)都明顯下降。5.裸鼠移植瘤瘤體在大小約5mm左右時(shí)開始給予各組處理,四周后載基因磁性金納米組及載基因磁性金納米外加磁場(chǎng)組裸鼠移植瘤大小明顯小于其他三組(P0.05)。6.光鏡下觀察各組瘤體組織HE染色結(jié)果并未發(fā)現(xiàn)顯著性差異,但I(xiàn)HC結(jié)果顯示載基因磁性金納米組及載基因磁性金納米外加磁場(chǎng)組裸鼠移植瘤組織Bag-1基因及腫瘤相關(guān)C-myc, P-catenin基因的表達(dá)明顯下調(diào),但其兩者間并無明顯差異。7. RT-PCR和Western blot法檢測(cè)結(jié)果顯示載基因磁性金納米組及載基因磁性金納米外加磁場(chǎng)組裸鼠移植瘤組織Bag-1基因在mRNA水平(P0.05)和蛋白水平(P0.05)的明顯低于其他三組,但這兩組組間差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究表明腫瘤相關(guān)C-myc,β-catenin基因,同時(shí)也是Wnt/β-catenin信號(hào)通路重要分子,隨著Bag-1基因的抑制下調(diào),其表達(dá)也相應(yīng)下降。[結(jié)論]復(fù)合磁性金納米基因載體制備相對(duì)簡(jiǎn)易,成本低,細(xì)胞毒性小,作為基因載體具有一定優(yōu)越性。本實(shí)驗(yàn)中磁性金納米載體介導(dǎo)Bag-1基因RNAi重組質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)入人結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞,導(dǎo)入的外源基因在細(xì)胞內(nèi)順利表達(dá)表達(dá)。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)Bag-1基因是一種抗凋亡基因與結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)歸有著密切的聯(lián)系。實(shí)驗(yàn)還提示Bag-1基因與結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制可能與Wnt/β-catenin信號(hào)通路異常相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)成功制備了一種新型磁性金納米基因載體,其介導(dǎo)的RNAi重組質(zhì)粒沉默Bag-1基因治療結(jié)腸癌的方法是一種有效的腫瘤基因治療方法。
【關(guān)鍵詞】：結(jié)腸癌 基因治療 Bag-1基因 小干擾RNA 磁性金納米微粒
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R735.35;R450
【目錄】：

• 中文摘要6-10
• 英文摘要10-15
• 符號(hào)說明15-17
• 前言17-19
• 實(shí)驗(yàn)材料19-26
• 實(shí)驗(yàn)方法26-39
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果39-44
• 討論44-47
• 結(jié)論47-48
• 附圖48-53
• 參考文獻(xiàn)53-56
• 致謝56-57
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表論文57-58
• 學(xué)位論文評(píng)閱及答辯情況表58

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