本文關(guān)鍵詞：蘆筍雌雄花發(fā)育轉(zhuǎn)錄組分析及性別決定相關(guān)miRNA靶基因的鑒定

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【摘要】：植物性別決定是指雌、雄性器官產(chǎn)生差異并分離到不同個體形成具有單一性別特征個體的過程,性別決定模式具有不穩(wěn)定性和遺傳多樣性的特點。在植物性別決定過程中,植物性染色體及其所承載的性別決定基因起主導(dǎo)作用,而microRNA(miRNA)可以通過調(diào)控性別決定基因的表達(dá)來影響植物的性別決定,此外,環(huán)境因素以及植物激素等外在和內(nèi)在因素也會影響植物的性別表達(dá)。目前,涉及植物性別表達(dá)中基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的研究較少。蘆筍(Asparagus officinalis L.)是一種在世界范圍內(nèi)廣泛種植的重要保健型蔬菜,其作為典型的雌雄異株植物,性染色體處于植物性染色體進(jìn)化的早期,是研究植物性染色體進(jìn)化和兩性植物起源的理想材料,也是研究植物性別決定與性別分化的重要模式植物。本論文以蘆筍不同發(fā)育時期的雄花和雌花為材料,在形態(tài)和細(xì)胞學(xué)觀察的基礎(chǔ)上,利用RNA-seq技術(shù)比較了雄花和雌花在性別分化前后的轉(zhuǎn)錄組差異,鑒定了參與蘆筍性別決定與雌、雄花分化相關(guān)的重要基因和miRNA靶基因,并利用分子和生理生化技術(shù)證實了植物激素和糖類代謝參與調(diào)控蘆筍性別決定過程。研究結(jié)果為深入揭示植物性別決定系統(tǒng)調(diào)控的分子機(jī)理提供了重要的理論基礎(chǔ),同時對于人為控制植物性型表現(xiàn)、選育全雄系蘆筍品種、提高蘆筍產(chǎn)量與品質(zhì)等方面具有重要的實踐意義。主要研究結(jié)果如下：(1)以蘆筍品種‘'Grande"為材料,利用體視顯微鏡與掃描電鏡(SEM)比較了雄花和雌花的發(fā)育過程,明確了蘆筍從兩性花原基轉(zhuǎn)變?yōu)閱涡曰ǖ年P(guān)鍵時期,表明在花蕾長度達(dá)2.0 mm時,雄花和雌花開始出現(xiàn)明顯的形態(tài)差異。進(jìn)一步運用RNA-seq技術(shù)對蘆筍性別決定前、中、后三個代表時期,即0.5 mm、2.0mm和4.0 mm長度的雌、雄花(蕾)進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測序分析,組裝了一個擁有93,658個Unigene的數(shù)據(jù)庫。雌、雄花之間有4,130個基因存在顯著的表達(dá)差異,并且差異表達(dá)基因(DEGs)主要集中在后兩個時期,即雌、雄花之間呈現(xiàn)明顯形態(tài)學(xué)差異的時期。根據(jù)對DEGs的表達(dá)模式分析,進(jìn)一步篩選到了17個性別偏向表達(dá)且與花器官發(fā)育相關(guān)的重要基因,其中參與雄蕊和雌蕊發(fā)育的轉(zhuǎn)錄因子可能參與調(diào)控蘆筍的性別決定。通過分析花發(fā)育過程中基因的表達(dá)變化,發(fā)現(xiàn)4個基因隨著雄花的發(fā)育在中后期表達(dá)水平顯著升高,而它們在雌花中表達(dá)水平下降,暗示著它們可能對雄性器官的形態(tài)建成具有重要作用。此外,我們在蘆筍雌、雄花之間鑒定了390個SNP,分布于343個Unigene,這些分子標(biāo)記對于蘆筍的全雄育種以及遺傳圖譜的構(gòu)建具有一定意義。(2)利用GO富集分析以及pathway分析,對蘆筍雌、雄花之間的DEGs進(jìn)行功能分類。結(jié)果表明,64個基因涉及到植物激素和糖類的生物合成與降解,暗示著植物激素和糖類可能參與調(diào)控蘆筍的性別決定與雌、雄花發(fā)育。從中篩選出了29個參與植物激素和糖類代謝的關(guān)鍵酶基因,通過分析它們在雌、雄花之間的表達(dá)模式,并利用qRT-PCR驗證,發(fā)現(xiàn)葡萄糖、蔗糖和淀粉代謝相關(guān)基因的表達(dá)水平在雌、雄花發(fā)育過程中發(fā)生顯著變化；赤霉素、細(xì)胞分裂素,以及油菜素內(nèi)酯的合成酶基因具有雄花偏向性,而生長素和茉莉酸的合成酶基因具有雌花偏向性。為進(jìn)一步探究內(nèi)源激素在蘆筍雌、雄花中的分布模式,我們利用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法和酶聯(lián)免疫吸附法測定了不同發(fā)育時期蘆筍雌、雄花中赤霉素、生長素和茉莉酸的含量,結(jié)果表明,赤霉素在雄花中含量較高,而生長素和茉莉酸在雌花中含量較高,表明一些重要的代謝酶基因的表達(dá)水平變化影響植物內(nèi)源激素的積累,進(jìn)而調(diào)控蘆筍的性別決定與雌、雄花的分化。(3)利用轉(zhuǎn)錄組測序構(gòu)建的Unigene數(shù)據(jù)庫,運用生物信息學(xué)的方法對鑒定的蘆筍雌雄株之間差異表達(dá)的miRNA進(jìn)行靶基因預(yù)測,共預(yù)測得到了27個miRNA的206個潛在靶基因,它們大多是對植物生長發(fā)育起重要調(diào)控作用的轉(zhuǎn)錄因子,且有24個預(yù)測的靶基因在蘆筍雄花和雌花之間差異表達(dá),暗示著它們很可能參與了蘆筍雌、雄花分化。運用RLM-5'RACE法對其中4個miRNA的10個靶基因進(jìn)行驗證,發(fā)現(xiàn)miRNA可以誘導(dǎo)其靶基因發(fā)生剪切作用,表明靶基因預(yù)測的準(zhǔn)確度較高。為了篩選出與蘆筍性別分化相關(guān)的miRNA及其靶基因,我們進(jìn)一步對雌、雄個體中差異表達(dá)的miRNA及其靶基因在不同發(fā)育時期雌、雄花中進(jìn)行qRT-PCR分析,發(fā)現(xiàn)miR160d在雌花中上調(diào)表達(dá)并負(fù)調(diào)控生長素響應(yīng)因子(ARFs),而miR396f在雄花發(fā)育中期上調(diào)表達(dá)并負(fù)調(diào)控生長調(diào)節(jié)因子(GRFs),暗示著這兩個miRNA很可能參與調(diào)控蘆筍的性別決定與雌、雄花分化,且miR160d通過對生長素的信號傳導(dǎo)途徑的調(diào)控行使其功能。
【關(guān)鍵詞】：蘆筍 性別決定 雌花 雄花 轉(zhuǎn)錄組 差異表達(dá)基因 miRNA 激素
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S644.6
【目錄】：

• 致謝6-7
• 摘要7-9
• Abstract9-12
• 縮略詞表12-15
• 前言15-17
• 1 文獻(xiàn)綜述17-37
• 1.1 植物性染色體進(jìn)化研究進(jìn)展17-20
• 1.1.1 植物性染色體的起源17-18
• 1.1.2 植物性染色體的演變18-19
• 1.1.3 遺傳退化與劑量補償效應(yīng)19-20
• 1.2 植物性別決定基因研究進(jìn)展20-23
• 1.2.1 植物性染色體連鎖基因的挖掘20-22
• 1.2.2 植物性別決定基因的分離與鑒定22-23
• 1.3 miRNA參與調(diào)控植物性別決定與分化23-26
• 1.3.1 植物miRNA的形成與作用機(jī)制23-24
• 1.3.2 植物性別決定與分化相關(guān)的miRNA24-26
• 1.4 激素與糖信號參與調(diào)控植物性別決定與分化26-29
• 1.4.1 植物激素調(diào)控性別決定與分化26-28
• 1.4.2 糖類代謝與植物性別分化28-29
• 1.5 蘆筍性別決定機(jī)制研究進(jìn)展29-32
• 1.5.1 蘆筍雌雄花分化及其生理生化特性的研究29-30
• 1.5.2 蘆筍性別決定基因及其連鎖分子標(biāo)記的鑒定30-32
• 1.6 轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究概況32-37
• 1.6.1 轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)32-33
• 1.6.2 轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究的應(yīng)用33-37
• 2 蘆筍不同發(fā)育時期雌雄花形態(tài)學(xué)特征研究及轉(zhuǎn)錄組測序分析37-57
• 2.1 材料與方法38-44
• 2.1.1 植物材料38
• 2.1.2 主要試劑與儀器38-39
• 2.1.3 花器官的形態(tài)觀察與比較39-40
• 2.1.4 轉(zhuǎn)錄組的高通量測序40-42
• 2.1.5 基因功能注釋42-43
• 2.1.6 差異表達(dá)基因篩選43
• 2.1.7 SNP的鑒定43-44
• 2.2 結(jié)果與分析44-53
• 2.2.1 蘆筍雌雄花發(fā)育的形態(tài)學(xué)特征與測序樣品的選擇44-46
• 2.2.2 RNA-seq數(shù)據(jù)分析46-50
• 2.2.3 蘆筍雌雄花間差異表達(dá)基因分析50-52
• 2.2.4 蘆筍花發(fā)育不同時期間差異表達(dá)基因分析52-53
• 2.2.5 蘆筍雄花與雌花間SNP的鑒定53
• 2.3 討論53-57
• 2.3.1 蘆筍性別分化過程中兩性花向單性花的轉(zhuǎn)變53-54
• 2.3.2 蘆筍雌雄花發(fā)育過程中基因表達(dá)模式分析54
• 2.3.3 基于表達(dá)特征預(yù)測蘆筍性別決定相關(guān)基因54-57
• 3 蘆筍雌雄花不同發(fā)育時期差異表達(dá)基因的功能分析與驗證57-79
• 3.1 材料與方法59-63
• 3.1.1 植物材料59
• 3.1.2 主要試劑與儀器59
• 3.1.3 差異表達(dá)基因的GO功能分類59
• 3.1.4 差異表達(dá)基因的代謝通路預(yù)測59-60
• 3.1.5 特定代謝途徑相關(guān)基因的篩選60
• 3.1.6 qRT-PCR驗證基因表達(dá)特征60-62
• 3.1.7 植物內(nèi)源激素含量的測定62-63
• 3.2 結(jié)果與分析63-76
• 3.2.1 蘆筍雌雄花間差異表達(dá)基因的GO功能富集分析63-68
• 3.2.2 蘆筍雌雄花間差異表達(dá)基因的Pathway富集分析68-69
• 3.2.3 植物激素代謝相關(guān)基因的表達(dá)特征69-70
• 3.2.4 糖類代謝相關(guān)基因的表達(dá)特征70-71
• 3.2.5 基因表達(dá)模式的qRT-PCR驗證71-75
• 3.2.6 蘆筍雌雄花不同發(fā)育時期內(nèi)源生長素、赤霉素和茉莉酸的含量變化75-76
• 3.3 討論76-79
• 3.3.1 植物激素調(diào)控蘆筍性別決定與性別分化76-78
• 3.3.2 糖信號參與調(diào)控蘆筍性別分化78-79
• 4 基于蘆筍轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)對性別分化相關(guān)miRNA靶基因的鑒定與表達(dá)分析79-97
• 4.1 材料與方法81-87
• 4.1.1 植物材料81
• 4.1.2 主要試劑與儀器81
• 4.1.3 運用生物信息學(xué)方法預(yù)測miRNA靶基因81-82
• 4.1.4 運用RLM-5'RACE法驗證miRNA靶基因82-86
• 4.1.5 miRNA及其靶基因的qRT-PCR分析86-87
• 4.2 結(jié)果與分析87-92
• 4.2.1 利用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫預(yù)測蘆筍雌雄株差異表達(dá)miRNA的靶基因87-88
• 4.2.2 運用RLM-5'RACE法驗證得到蘆筍4個miRNA的10個靶基因88-89
• 4.2.3 蘆筍雌雄花發(fā)育不同時期miRNA及其靶基因的表達(dá)模式分析89-92
• 4.3 討論92-97
• 4.3.1 蘆筍雌雄個體差異表達(dá)miRNA的靶基因預(yù)測與驗證92-93
• 4.3.2 蘆筍性別分化相關(guān)miRNA及其靶基因的篩選與鑒定93-94
• 4.3.3 miR160d調(diào)控蘆筍性別分化的模式淺析94-97
• 5 結(jié)論97-99
• 參考文獻(xiàn)99-109
• 附錄109-135

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本文編號：587527