發(fā)布時(shí)間：2017-07-20 17:28

  本文關(guān)鍵詞：西伯利亞白刺高親和鉀離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的克隆及特性分析

  更多相關(guān)文章： 西伯利亞白刺 高親和鉀離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 基因克隆 啟動子 表達(dá)特性

【摘要】：白刺屬(Nitraria L.)是蒺藜科(Zygophyllaceae)的一個(gè)小屬,主要生長在荒漠和半荒漠地區(qū),具有較強(qiáng)的耐干旱、耐鹽堿和抗風(fēng)沙能力,所以研究白刺的耐鹽機(jī)理,開發(fā)其耐鹽基因資源可為農(nóng)作物和林木的遺傳改良提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。高親和鉀離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(High affactive K+ transpoter, HKT)位于質(zhì)膜上,調(diào)控植物重吸收鈉離子,維持胞內(nèi)穩(wěn)定的Na+/K+平衡,從而提高植物耐鹽性。植物在蒸騰拉力作用下將根部Na+通過木質(zhì)部薄壁細(xì)胞向上運(yùn)輸,HKT1將莖木質(zhì)部中過多的Na+經(jīng)共質(zhì)體途徑卸載到韌皮部,再運(yùn)輸回根部,以防止地上部分Na+積累過多。本研究利用同源克隆技術(shù)分離了西伯利亞白刺(Nitraria sibirica Pall)高親和鉀離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因(命名為NsHKTl)及其啟動子序列,并對其表達(dá)特性進(jìn)行了研究。結(jié)果表明：克隆了1866bp NsHKTl cDNA序列,包含1662bp的開放閱讀框,在進(jìn)化上與番茄(茄科)S1HKT1蛋白具有較近的親緣關(guān)系。利用Tail-PCR技術(shù)克隆了943bp NsHKT1啟動子序列,對其進(jìn)行生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示,NsHKTl啟動子區(qū)域含有2個(gè)干旱脫水響應(yīng)元件(ACGTATERD1)、1個(gè)鹽誘導(dǎo)元件(GT1GMSCAM4)、1個(gè)低溫響應(yīng)元件(LTRE1AVBLT49)、4個(gè)生長素響應(yīng)元件(CATATGGMSAUR)等,表明NsHKT1基因的表達(dá)可能受環(huán)境及生長發(fā)育因子的調(diào)控。實(shí)時(shí)熒光定量結(jié)果顯示,NsHKT1基因在白刺莖中表達(dá)量高于在根和葉中的表達(dá)量,在受低溫、NaCl和干旱脅迫時(shí)其表達(dá)量明顯上調(diào)。為了進(jìn)一步研究NSHKT1基因功能及異源表達(dá)特性,分別構(gòu)建了pORE-NsHKT1::GUS、 pBI101-NsHKT1真核表達(dá)載體及pET-32a(+)-NsHKT1原核表達(dá)載體。真核表達(dá)載體利用農(nóng)瘤桿菌介導(dǎo)的花序浸染法對擬南芥進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)基因植物表分析結(jié)果顯示,NsHKT1啟動子引導(dǎo)的GUS蛋白主要表達(dá)在轉(zhuǎn)基因擬南芥葉脈中,與其將木質(zhì)部中過多的Na+經(jīng)共質(zhì)體途徑卸載到韌皮部的功能相一致。鹽脅迫下超表達(dá)NsHKT1轉(zhuǎn)基因擬南芥長勢優(yōu)于野生型植株。原核表達(dá)載體導(dǎo)入大腸桿菌中,超表達(dá)NsHKT1基因大腸桿菌抵御非生物脅迫分析顯示,鹽、干旱、冷脅迫下其生長優(yōu)于非轉(zhuǎn)基因菌株。本研究成果為分析NsHKT1表達(dá)特性、功能及作用機(jī)理,及利用該基因改良農(nóng)作物和林木的耐鹽性提供理論和試驗(yàn)依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：西伯利亞白刺 高親和鉀離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 基因克隆 啟動子 表達(dá)特性
【學(xué)位授予單位】：內(nèi)蒙古大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：Q943.2
【目錄】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-10
• 本文所使用的縮略詞表10-13
• 第一章 文獻(xiàn)綜述13-21
• 1.1 國內(nèi)外研究現(xiàn)狀13-19
• 1.1.1 鹽脅迫對植物的危害及植物耐鹽機(jī)理13-14
• 1.1.2 HKT基因研究進(jìn)展14-19
• 1.2 研究意義及研究技術(shù)路線19-21
• 1.2.1 研究意義19-20
• 1.2.2 研究技術(shù)路線20-21
• 第二章 西伯利亞白剌HKT1 cDNA全長克隆及生物信息學(xué)分析21-35
• 2.1 材料和方法21-29
• 2.1.1 植物材料及培養(yǎng)21
• 2.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑及其配制21-22
• 2.1.3 NsHKT1基因的克隆22-25
• 2.1.4 RACE技術(shù)克隆NsHKT1基因末端序列25-29
• 2.1.5 NsHKT1基因的生物信息學(xué)分析29
• 2.2 結(jié)果和分析29-35
• 2.2.1 RNA的凝膠變性電泳結(jié)果29-30
• 2.2.2 NsHKT1基因序列的克隆30
• 2.2.3 NsHKT1基因末端序列的克隆30-31
• 2.2.4 cDNA全長的克隆31
• 2.2.5 NsHKT1基因生物信息學(xué)分析31-35
• 第三章 西伯利亞白刺HKT1基因的表達(dá)特性分析35-49
• 3.1 材料和方法35-43
• 3.1.1 NsHKT1基因的表達(dá)特性分析35-37
• 3.1.2 NsHKT1基因啟動子序列克隆及分析37-39
• 3.1.3 pORE R1-pNsHKT1::GUS表達(dá)載體的構(gòu)建39-41
• 3.1.4 擬南芥遺傳轉(zhuǎn)化、篩選、鑒定41-42
• 3.1.5 NsHKT1：：GUS蛋白的檢測42-43
• 3.2 結(jié)果和分析43-49
• 3.2.1 NsHKT1基因的表達(dá)特性分析43-44
• 3.2.2 NsHKT1基因啟動子序列克隆和功能元件分析44-46
• 3.2.3 pORE R1-pNsHKT1：：GUS表達(dá)載體的構(gòu)建46-47
• 3.2.4 擬南芥遺傳轉(zhuǎn)化、篩選、鑒定47-48
• 3.2.5 NsHKT1：：GUS蛋白的檢測48-49
• 第四章 西伯利亞白刺HKT1基因的功能分析49-63
• 4.1 材料和方法49-55
• 4.1.1 pET-32a(+)-NsHKT1載體的構(gòu)建49-53
• 4.1.2 pBI101-NsHKT1載體的構(gòu)建53-55
• 4.2 結(jié)果和分析55-63
• 4.2.1 pET-32a(+)-NsHKT1載體的構(gòu)建55-56
• 4.2.2 大腸桿菌的轉(zhuǎn)化及鑒定56
• 4.2.3 NsHKT1蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)56-57
• 4.2.4 轉(zhuǎn)基因大腸桿菌的抗逆性檢測57-60
• 4.2.5 pBI101-NsHKT1載體的構(gòu)建60
• 4.2.6 擬南芥遺傳轉(zhuǎn)化、篩選、鑒定60-61
• 4.2.7 轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽性分析61-63
• 第五章 討論63-66
• 5.1 NsHKT1基因的分子特性63
• 5.2 NsHKT1基因的表達(dá)特性63-64
• 5.3 NsHKT1基因在大腸桿菌中的表達(dá)及抗逆性分析64-65
• 5.4 NsHKT1基因在擬南芥中的表達(dá)及耐鹽性分析65-66
• 第六章 結(jié)論66-67
• 參考文獻(xiàn)67-74
• 附錄74-75
• 附錄 白刺N(yùn)sHKT1基因cDNA及推測的氨基酸序列74-75
• 致謝75

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本文編號：569215