本文關(guān)鍵詞：中國(guó)野生山葡萄VaERD15基因的功能驗(yàn)證

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【摘要】：葡萄在全國(guó)乃至全世界都有很廣泛的種植。目前全球普遍種植且品質(zhì)優(yōu)良的葡萄品種多屬歐亞種(Vitis vinifera),但是其抗寒性較差,不適應(yīng)于我國(guó)北方寒冷地區(qū)種植。中國(guó)野生山葡萄(Vitis amurensis)是葡萄屬中抗寒性最強(qiáng)的種,可耐-40℃的低溫。如果能將歐亞種葡萄的優(yōu)良性狀與山葡萄的抗寒性結(jié)合起來(lái),培育抗寒優(yōu)質(zhì)的葡萄新品種,將會(huì)擴(kuò)大葡萄的種植范圍。研究中國(guó)野生山葡萄抗寒相關(guān)基因,并將其轉(zhuǎn)入歐亞種葡萄進(jìn)行分子育種,是培育抗寒優(yōu)質(zhì)葡萄新品種的重要途徑。本研究將從野生山葡萄中擴(kuò)增獲得的VaERD15基因分別導(dǎo)入哥倫比亞生態(tài)型擬南芥(Arabidopsis thaliana L.)和歐亞種葡萄品種‘紅地球’(Vitis vinifera cv.Red Globe),獲得了轉(zhuǎn)基因植株,然后對(duì)其進(jìn)行低溫脅迫處理,并以未轉(zhuǎn)基因植株為對(duì)照,取葉片分別進(jìn)行分子檢測(cè)、表型觀察及生理指標(biāo)測(cè)定,通過(guò)比較與分析,進(jìn)行了VaERD15基因功能的初步驗(yàn)證。取得的具體結(jié)果如下:1.轉(zhuǎn)VaERD15基因擬南芥抗寒性檢測(cè)(1)利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將VaERD15基因轉(zhuǎn)入野生型擬南芥,通過(guò)PCR檢測(cè)和Southern blot檢測(cè)篩選出轉(zhuǎn)基因擬南芥植株,然后進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析和Western blot分析其在低溫脅迫下的表達(dá)模式。結(jié)果表明,隨著低溫處理時(shí)間增加,轉(zhuǎn)基因擬南芥中VaERD15基因的表達(dá)量也隨之增加,而野生型擬南芥中沒(méi)有相關(guān)表達(dá)。(2)通過(guò)對(duì)低溫處理下轉(zhuǎn)基因和野生型擬南芥表型變化觀察發(fā)現(xiàn),隨著低溫脅迫時(shí)間延長(zhǎng),野生型擬南芥大部分有嚴(yán)重凍害發(fā)生,而轉(zhuǎn)基因擬南芥只有少數(shù)輕度凍害發(fā)生。(3)對(duì)轉(zhuǎn)基因擬南芥和野生型分別測(cè)定與抗寒性有關(guān)的生理生化指標(biāo),包括相對(duì)電導(dǎo)率、可溶性糖、可溶性蛋白、脯氨酸、丙二醛以及超氧化物歧化酶、超氧化物酶和過(guò)氧化氫酶三種酶活性等,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因擬南芥上述各項(xiàng)指標(biāo)明顯優(yōu)于野生型擬南芥。2.轉(zhuǎn)VaERD15基因紅地球葡萄抗寒性檢測(cè)(1)通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將VaERD15基因轉(zhuǎn)入歐亞種葡萄品種‘紅地球’原胚團(tuán)(PEM)中,通過(guò)含有除草劑(basta)的培養(yǎng)基篩選,并對(duì)篩選出的植株進(jìn)行PCR檢測(cè)和進(jìn)一步的Southern blot檢測(cè),最終獲得轉(zhuǎn)基因株系10個(gè)。(2)對(duì)獲得的‘紅地球’葡萄轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行擴(kuò)繁,然后選取兩個(gè)長(zhǎng)勢(shì)相近的株系進(jìn)行低溫處理,取葉片進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western blot檢測(cè),結(jié)果顯示,低溫處理時(shí)間越長(zhǎng),VaERD15基因表達(dá)量也隨之增加,且轉(zhuǎn)基因‘紅地球’葡萄的表達(dá)量明顯高于對(duì)照。(3)對(duì)轉(zhuǎn)基因‘紅地球’葡萄和未轉(zhuǎn)基因植株分別測(cè)定與抗寒性有關(guān)的生理生化指標(biāo),包括相對(duì)電導(dǎo)率、可溶性糖、可溶性蛋白、脯氨酸、丙二醛以及超氧化物歧化酶、超氧化物酶和過(guò)氧化氫酶三種酶活性等,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因‘紅地球’葡萄各項(xiàng)指標(biāo)優(yōu)于未轉(zhuǎn)基因植株。以上結(jié)果表明,在低溫脅迫下,與野生型相比,轉(zhuǎn)VaERD15基因的擬南芥和‘紅地球’植株均表現(xiàn)出更強(qiáng)的耐寒性,因此說(shuō)明來(lái)自中國(guó)野生山葡萄的轉(zhuǎn)錄因子基因VaERD15在山葡萄的抗寒過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。
【關(guān)鍵詞】：中國(guó)野生山葡萄 紅地球葡萄 擬南芥 抗寒性 VaERD15 轉(zhuǎn)基因 功能驗(yàn)證
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S663.1
【目錄】：

• 摘要6-8
• Abstrac8-13
• 第一章 文獻(xiàn)綜述13-22
• 1.1 植物的抗寒性13-17
• 1.1.1 植物抗寒機(jī)理13-15
• 1.1.2 葡萄抗寒性研究進(jìn)展15-17
• 1.2 脫水誘導(dǎo)早期應(yīng)答（ERD）基因的研究進(jìn)展17-18
• 1.3 植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究進(jìn)展18-22
• 1.3.1 植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)發(fā)展歷史及現(xiàn)狀18-19
• 1.3.2 植物轉(zhuǎn)基因的方法19-22
• 第二章 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的VaERD15基因轉(zhuǎn)化擬南芥的研究22-28
• 2.1 材料和試劑22
• 2.1.1 試驗(yàn)材料22
• 2.1.2 主要試劑22
• 2.1.3 主要儀器22
• 2.2 方法22-24
• 2.2.1 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的擬南芥轉(zhuǎn)化22-23
• 2.2.2 轉(zhuǎn)基因擬南芥的篩選及分子檢測(cè)23
• 2.2.3 轉(zhuǎn)基因與野生型擬南芥低溫處理并觀察表型變化23-24
• 2.2.4 轉(zhuǎn)基因擬南芥低溫脅迫下表達(dá)水平的分析24
• 2.3 結(jié)果與分析24-28
• 2.3.1 轉(zhuǎn)基因擬南芥的分子檢測(cè)24-26
• 2.3.2 轉(zhuǎn)基因與野生型擬南芥低溫脅迫下的表型變化26
• 2.3.3 轉(zhuǎn)基因擬南芥植株中VaERD15基因在低溫脅迫下表達(dá)水平的變化26-28
• 第三章 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的VaERD15基因轉(zhuǎn)化‘紅地球’葡萄的研究28-34
• 3.1 材料和試劑28
• 3.1.1 試驗(yàn)材料28
• 3.1.2 主要試劑28
• 3.1.3 主要儀器設(shè)備28
• 3.2 方法28-30
• 3.2.1 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的VaERD15基因轉(zhuǎn)化‘紅地球’葡萄28-29
• 3.2.2 轉(zhuǎn)VaERD15基因‘紅地球’葡萄的分子檢測(cè)29-30
• 3.2.3 轉(zhuǎn)基因‘紅地球’植株中VaERD15基因在低溫脅迫下表達(dá)水平的變化30
• 3.3 結(jié)果與分析30-34
• 3.3.1 轉(zhuǎn)基因‘紅地球’葡萄的篩選、繼代、成苗與煉苗30-31
• 3.3.2 轉(zhuǎn)基因‘紅地球’葡萄的PCR檢測(cè)31
• 3.3.3 轉(zhuǎn)基因‘紅地球’葡萄的Southern blot檢測(cè)31-32
• 3.3.4 轉(zhuǎn)基因‘紅地球’植株中VaERD15基因在低溫脅迫下表達(dá)水平的變化32-34
• 第四章 轉(zhuǎn)基因植株低溫脅迫下多個(gè)生理指標(biāo)的測(cè)定34-44
• 4.1 材料和試劑34
• 4.1.1 試驗(yàn)材料34
• 4.1.2 主要試劑34
• 4.1.3 主要儀器34
• 4.2 試驗(yàn)方法34-37
• 4.2.1 取樣34
• 4.2.2 電導(dǎo)率測(cè)定34-35
• 4.2.3 游離脯氨酸測(cè)定35
• 4.2.4 丙二醛測(cè)定35
• 4.2.5 可溶性蛋白質(zhì)測(cè)定35
• 4.2.6 可溶性糖測(cè)定35-36
• 4.2.7 抗氧化酶活性的測(cè)定36-37
• 4.3 結(jié)果和分析37-44
• 4.3.1 電導(dǎo)率的測(cè)定結(jié)果37-38
• 4.3.2 游離脯氨酸的測(cè)定結(jié)果38-39
• 4.3.3 丙二醛的測(cè)定結(jié)果39-40
• 4.3.4 可溶性蛋白質(zhì)的測(cè)定結(jié)果40-41
• 4.3.5 可溶性糖的測(cè)定結(jié)果41-42
• 4.3.6 抗氧化酶的測(cè)定結(jié)果42-44
• 第五章 討論44-46
• 5.1 關(guān)于葡萄試驗(yàn)材料的選擇44
• 5.2 關(guān)于轉(zhuǎn)基因植株的篩選與檢測(cè)44
• 5.3 關(guān)于低溫脅迫與VaERD15基因表達(dá)的關(guān)系44-45
• 5.4 VaERD15基因與葡萄抗寒性的關(guān)系45-46
• 第六章 結(jié)論46-47
• 參考文獻(xiàn)47-53
• 致謝53-54
• 作者簡(jiǎn)介54

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本文編號(hào)：554012