本文關(guān)鍵詞：牛支原體二氫硫辛酸脫氫酶基因的克隆表達及缺失株的構(gòu)建

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【摘要】：牛支原體是牛呼吸系統(tǒng)的常見病原微生物,除導致牛呼吸系統(tǒng)嚴重疾病外,還可引起關(guān)節(jié)炎、角膜炎等一系列次生機能障礙。二氫硫辛酸脫氫酶是丙酮酸脫氫酶復合體重要組成部分,在生物體的能量代謝途徑中發(fā)揮重要作用,但目前關(guān)于牛支原體二氫硫辛酸脫氫酶的相關(guān)研究較為少見。因此,開展牛支原體二氫硫辛酸脫氫酶相關(guān)的研究以期在豐富牛支原體研究內(nèi)容的同時,也能極大地促進牛支原體相關(guān)診斷試劑和疫苗的開發(fā)。1.牛支原體二氫硫辛酸脫氫酶的原核表達及其多克隆抗體的制備參照GeneBank中牛支原體PG45株中的pdhd基因序列設(shè)計一對特異性引物,通過PCR擴增獲得牛支原體武威株pdhd基因并將其克隆至pMD19-T載體,在序列測定的基礎(chǔ)上以O(shè)verlap PCR完成基因優(yōu)化后,與pET-28a(+)載體連接,構(gòu)建原核表達載體pET-pdhd,轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3),經(jīng)IPTG誘導表達后成功獲得融合蛋白His-DLD,再經(jīng)SDS-PAGE電泳鑒定為上清表達;純化后的表達產(chǎn)物His-DLD免疫新西蘭大白兔以制備多克隆抗體,并通過ELISA檢測抗體效價。結(jié)果表明,重組融合蛋白His-DLD多抗血清與純化后的原核表達產(chǎn)物His-DLD可發(fā)生特異性結(jié)合反應。2.重組蛋白二氫硫辛酸脫氫酶比活性的測定應用連續(xù)監(jiān)測法對pdhd基因原核表達產(chǎn)物His-DLD的酶促活性進行了測定,結(jié)果表明表達產(chǎn)物His-DLD在底物NADH存在條件下,能將硫辛酰胺催化生成二氫硫辛酰胺,具有二氫硫辛酸脫氫酶活性,其最適反應溫度為25℃、pH為7.5;雙倒數(shù)作圖法求出其米氏常數(shù)Km(NADH)為9.72μmol/L,最大反應速率(V max)為25.6μmol/(L·min)。3.牛支原體pdhd基因缺失株的構(gòu)建從牛支原體武威株基因組擴增pdhd基因的上下游同源臂,通過Overlap PCR與含啟動子的慶大霉素抗性基因(Genr)融合,再與pUC19載體連接,構(gòu)建重組缺失質(zhì)粒pUC△pdhd。將重組質(zhì)粒pUC△pdhd電轉(zhuǎn)化導入牛支原體武威株感受態(tài)細胞中,在慶大霉素抗性壓力篩選下,重組質(zhì)粒pUC△pdhd與野生株的染色體發(fā)生了同源重組,Genr基因取代pdhd基因,從而獲得牛支原體pdhd基因缺失株。本研究結(jié)果可為深入研究牛支原體的能量代謝及二氫硫辛酸脫氫酶的其他生物學功能提供科學依據(jù),也為進一步深入探索牛支原體的致病機理奠定基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：牛支原體 二氫硫辛酸脫氫酶 酶活性 基因缺失
【學位授予單位】：甘肅農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S852.62
【目錄】：

• 摘要3-4
• Summary4-6
• 外文縮略語表6-11
• 第一部分 文獻綜述11-19
• 第一章 牛支原體、二氫硫辛酸脫氫酶及基因敲除的研究進展11-19
• 1 牛支原體及牛支原體相關(guān)疾病的研究進展11-14
• 1.1 牛支原體的形態(tài)及生物學特性11-12
• 1.2 牛支原體病的流行病學特點12
• 1.3 牛支原體病的臨床癥狀12-13
• 1.4 牛支原體病的病理變化13
• 1.5 牛支原體病的診斷13
• 1.5.1 病原學診斷13
• 1.5.2 血清學診斷13
• 1.5.3 分子生物學診斷13
• 1.6 牛支原體病的防治13-14
• 2 二氫硫辛酸脫氫酶研究進展14-16
• 2.1 丙酮酸脫氫酶復合體與二氫硫辛酸脫氫酶14
• 2.2 二氫硫辛酸脫氫酶的組成結(jié)構(gòu)14
• 2.3 二氫硫辛酸脫氫酶的催化機理14-15
• 2.3.1 α-酮酸脫氫酶復合體中二氫硫辛酸脫氫酶的催化機制14-15
• 2.3.2 二氫硫辛酸脫氫酶在甘氨酸裂解系統(tǒng)（GCS）中的催化機理15
• 2.4 二氫硫辛酸脫氫酶的功能與臨床意義15-16
• 2.5 牛支原體二氫硫辛酸脫氫酶16
• 3 基因敲除及同源重組的原理16-18
• 3.1 基因重組載體的構(gòu)建17
• 3.2 胚胎干細胞的獲得17
• 3.3 同源重組17
• 3.4 擊中細胞的篩選17
• 3.5 表型研究17
• 3.6 純合體的獲得17-18
• 4 本研究的目的和意義18-19
• 第二部分 試驗研究19-42
• 第二章 牛支原體二氫硫辛酸脫氫酶基因的克隆及原核表達19-28
• 1 材料19-21
• 1.1 試驗動物、菌種與載體19
• 1.2 儀器19-20
• 1.3 試劑20-21
• 1.3.1 主要試劑20
• 1.3.2 試劑配制20-21
• 1.3.3 培養(yǎng)基配制21
• 2 方法21-25
• 2.1 引物設(shè)計21
• 2.2 牛支原體基因組的提取21-22
• 2.3 牛支原體pdhd基因的克隆22
• 2.4 牛支原體pdhd基因的優(yōu)化22-23
• 2.5 原核表達載體p ET-pdhd的構(gòu)建23-24
• 2.6 pdhd基因的原核表達和蛋白純化24
• 2.6.1 pdhd基因原核表達形式的確定24
• 2.6.2 pdhd基因原核表達的優(yōu)化24
• 2.6.3 His-DLD蛋白的純化及定量24
• 2.7 兔抗His-DLD多抗的制備24-25
• 2.7.1 動物免疫24-25
• 2.7.2 多克隆抗體效價的檢測25
• 3 結(jié)果25-27
• 3.1 pdhd基因的克隆及原核表達載體的構(gòu)建25-26
• 3.2 His-DLD原核表達及表達產(chǎn)物的純化26
• 3.3 多克隆抗體效價的檢測26-27
• 4 討論27-28
• 第三章 牛支原體pdhd基因原核表達產(chǎn)物酶活性的測定28-34
• 1 材料28-29
• 1.1 儀器28
• 1.2 試劑28-29
• 1.2.1 主要試劑28
• 1.2.2 試劑配制28-29
• 2 方法29-30
• 2.1 His-DLD比活性的測定30
• 2.2 不同溫度對His-DLD活性的影響30
• 2.3 不同p H對His-DLD活性的影響30
• 2.4 不同底物濃度對His-DLD活性的影響30
• 3 結(jié)果30-32
• 3.1 His-DLD酶促活性30-31
• 3.2 溫度對His-DLD酶促活性的影響31
• 3.3 p H對His-DLD酶促活性的影響31-32
• 3.4 His-DLD的米氏常數(shù)及最大反應速率32
• 4 討論32-34
• 第四章 牛支原體pdhd基因缺失株的構(gòu)建34-42
• 1 材料34-35
• 1.1 菌種與載體34
• 1.2 儀器34
• 1.3 試劑34-35
• 1.3.1 主要試劑34
• 1.3.2 試劑配制34-35
• 2 方法35-38
• 2.1 試驗原理35
• 2.2 慶大霉素MIC的測定35
• 2.3 引物設(shè)計35-36
• 2.4 上下游同源臂及慶大基因的克隆36-37
• 2.5 重組缺失質(zhì)粒pUC△pdhd的構(gòu)建37
• 2.6 電轉(zhuǎn)化37-38
• 2.7 基因缺失株的初步鑒定38
• 3 結(jié)果38-41
• 3.1 慶大霉素MIC測定結(jié)果38-39
• 3.2 pdhd基因上下游同源臂及慶大基因的擴增39
• 3.3 缺失質(zhì)粒pUC△pdhd的構(gòu)建39-40
• 3.4 突變菌株的獲得40
• 3.5 牛支原體pdhd基因缺失株的初步鑒定40-41
• 4 討論41-42
• 全文結(jié)論42-43
• 參考文獻43-49
• 致謝49-50
• 作者簡介50-51
• 導師簡介51-53

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