本文關(guān)鍵詞：苦蕎蘆丁降解酶基因多態(tài)性分析和蛋白重組表達(dá)及催化特性分析

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【摘要】：苦蕎種子中含有高活性的蘆丁降解酶(Rutin Degrading Enzyme,RDE),蘆丁降解酶屬于β-D-糖苷酶家族,能夠降解蘆丁生成槲皮素和蕓香糖苷,是造成苦蕎面粉苦味的主要原因。本研究利用實(shí)驗(yàn)室已克隆的蘆丁降解酶基因,設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增RDE基因組DNA,依據(jù)測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)蘆丁降解酶在基因組上存在3種拷貝形式rde1、rde2、rde3,其中rde1為無內(nèi)含子的基因形式,rde2和rde3為有內(nèi)含子的基因形式,rde3由12個(gè)外顯子組成,rde2在rde3的第8外顯子處插入新的內(nèi)含子形成了13個(gè)外顯子,兩者相比外顯子存在單堿基突變位點(diǎn),內(nèi)含子長度多態(tài)性是造成和兩者差異的主要原因。相同的是rde2和rde3內(nèi)含子中的AT含量高達(dá)70%,兩者剪接位點(diǎn)堿基保守且遵循GT-AG規(guī)則。由此推測(cè)rde2和rde3可能為蘆丁降解酶同源基因。在基因結(jié)構(gòu)分析的基礎(chǔ)上,構(gòu)建rde真核重組表達(dá)載體pPICZαA-rde并轉(zhuǎn)化畢赤酵母SMD1168H宿主菌,1%甲醇誘導(dǎo)誘導(dǎo)表達(dá)48 h后,表達(dá)上清硫酸銨分級(jí)沉淀,80%的丙酮洗滌溶解后,DEAE-Sepharose CL 6B純化的蛋白經(jīng)SDS-PAGE顯示分子量為75KDa,重組蘆丁降解酶(rRDE)分子量遠(yuǎn)大于預(yù)期分子量,PNGase F消化后分子量遷移到54 KDa,表明重組表達(dá)蛋白為N-連接的糖蛋白。研究建立了快速純化苦蕎籽粒蘆丁降解酶的方法。利用蘆丁降解酶對(duì)有機(jī)溶劑高耐受性的典型特性,基于不同濃度的甲醇對(duì)蘆丁降解酶提取及活性的影響,結(jié)合非變性膠原位染色和酶活性分析確定蘆丁降解酶提取最適甲醇濃度為40%,即在乙酸緩沖液提取后加入終濃度為40%的甲醇去除雜蛋白,在pH4.0條件下,提取液經(jīng)強(qiáng)陽離子層析柱SP-Sepharose HP一步純化得到分子量約為60 KDa的天然蘆丁降解酶(nRDE),純化效率可達(dá)70%左右。利用紫外分光光度計(jì)法對(duì)rRDE和nRDE的催化特性進(jìn)行了比較分析,結(jié)果顯示兩者催化蘆丁降解的最適p H均為5.0,rRDE最適溫度為50℃,nRDE最適溫度為40℃,催化蘆丁的Km分別為5.375 mmol/L和11.333 mmol/L,nRDE的最大反應(yīng)速率Vmax為是重組蛋白Vmax的10倍之多,推測(cè)不同來源蘆丁降解酶翻譯后修飾的不同是造成催化特性差異的主要原因。
【關(guān)鍵詞】：苦蕎 蘆丁降解酶 基因多態(tài)性 畢赤酵母 重組表達(dá) 催化特性
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：Q943.2
【目錄】：

• 摘要5-6
• abstract6-10
• 第一章 文獻(xiàn)綜述10-22
• 1.1 苦蕎簡介10
• 1.2 蘆丁的研究進(jìn)展10-12
• 1.2.1 蘆丁的概況10
• 1.2.2 蘆丁的藥理研究進(jìn)展10-12
• 1.3 降解蘆丁相關(guān)酶的研究進(jìn)展12-17
• 1.3.1 α-L鼠李糖苷酶的研究進(jìn)展12-13
• 1.3.2 β 糖苷酶的研究進(jìn)展13-15
• 1.3.3 β 糖苷酶的底物特異性及催化機(jī)制的研究15-16
• 1.3.4 β 糖苷酶的分子研究和重組表達(dá)16-17
• 1.4 畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)17-18
• 1.5 基因多樣性形成的原因18-20
• 1.5.1 外顯子的改變18-19
• 1.5.2 內(nèi)含子多樣性及其研究進(jìn)展19-20
• 1.5.3 可變剪接（AS）20
• 1.6 展望20-21
• 1.7 研究目的意義21-22
• 第二章 蘆丁降解酶基因組DNA多態(tài)性分析22-28
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料22
• 2.1.1 菌株22
• 2.1.2 工具酶與主要試劑22
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法22-24
• 2.2.1 苦蕎基因組DNA提取22
• 2.2.2 引物設(shè)計(jì)22-23
• 2.2.3 RDE基因組DNA多態(tài)性克隆測(cè)序23
• 2.2.4 轉(zhuǎn)化子的篩選與鑒定23-24
• 2.2.5 測(cè)序鑒定24
• 2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果24-27
• 2.3.1 RDE基因組DNA克隆24-27
• 2.4 討論與分析27-28
• 第三章 一種快速純化苦蕎籽粒蘆丁降解酶的方法28-34
• 3.1 實(shí)驗(yàn)材料28
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法28-31
• 3.2.1 不同濃度甲醇溶劑對(duì)蘆丁降解酶粗酶液提取及活性的影響28-29
• 3.2.2 蘆丁降解酶粗酶液SDS-PAGE檢測(cè)29
• 3.2.3 Native-PAGE酶譜法檢測(cè)蘆丁降解酶的活性。29-30
• 3.2.4 紫外分光光度計(jì)法檢測(cè)蘆丁降解酶粗酶液活性30
• 3.2.5 蘆丁降解酶的提取方法優(yōu)化30
• 3.2.6 蘆丁降解酶的純化30-31
• 3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析31-33
• 3.3.1 SDS-PAGE檢測(cè)不同濃度甲醇溶劑對(duì)蘆丁降解酶粗酶液提取的影響31
• 3.3.2 Native PAGE酶譜檢測(cè)不同濃度甲醇溶劑對(duì)蘆丁降解酶粗酶液活性的影響31-32
• 3.3.3 紫外分光光度計(jì)法檢測(cè)蘆丁降解酶粗酶液活性32
• 3.3.4 蘆丁降解酶的純化32-33
• 3.4 討論與分析33-34
• 第四章 蘆丁降解酶在畢赤酵母中的重組表達(dá)及純化34-41
• 4.1 實(shí)驗(yàn)材料34
• 4.1.2 工具酶與主要試劑34
• 4.1.3 試劑配制34
• 4.2 實(shí)驗(yàn)方法34-37
• 4.2.1 pPICZα A-rde分泌表達(dá)載體構(gòu)建34-35
• 4.2.2 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化35-36
• 4.2.3 重組轉(zhuǎn)化子的表達(dá)分析36
• 4.2.4 目的蛋白純化36-37
• 4.2.5 重組蛋白糖基化分析及與天然蛋白大小比較分析37
• 4.3 結(jié)果與分析37-39
• 4.3.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定37-38
• 4.3.2 轉(zhuǎn)化子PCR鑒定38
• 4.3.3 重組蛋白表達(dá)及純化分析38-39
• 4.3.4 重組蛋白糖基化分析及與天然蛋白大小比較分析39
• 4.4 討論與分析39-41
• 第五章 蘆丁降解酶的催化特性分析41-46
• 5.1 材料與試劑41
• 5.1.1 實(shí)驗(yàn)材料41
• 5.1.2 主要試劑配制41
• 5.2 實(shí)驗(yàn)方法41-42
• 5.2.1 RDE蛋白含量測(cè)定41
• 5.2.2 RDE酶活測(cè)定41-42
• 5.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果42-44
• 5.3.1 不同反應(yīng)時(shí)間對(duì)蘆丁降解酶活性的影響42
• 5.3.2 pH對(duì)酶活性的影響42-43
• 5.3.3 溫度對(duì)酶活性的影響43-44
• 5.3.4 RDE動(dòng)力學(xué)參數(shù)Km和Vmax44
• 5.4 討論與分析44-46
• 第六章 結(jié)論與展望46-48
• 6.1 結(jié)論46
• 6.2 展望46-48
• 參考文獻(xiàn)48-56
• 附錄56-60
• 致謝60-61
• 作者簡介61

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中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 錢鼎,李寅,堵國成,陳堅(jiān);由一株青霉菌產(chǎn)生的聚乙烯醇降解酶[J];應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào);2004年02期

2 宋朝霞;張穎;堵國成;李寅;陳堅(jiān);;一株產(chǎn)聚乙烯醇降解酶的紫色桿菌的發(fā)酵條件研究[J];高�；瘜W(xué)工程學(xué)報(bào);2006年05期

3 王能強(qiáng);趙維俊;梁芳;李會(huì)東;王棟;;聚乙烯醇降解酶產(chǎn)生菌發(fā)酵培養(yǎng)基響應(yīng)面法優(yōu)化研究[J];環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào);2010年06期

4 郭雅妮;崔雙科;趙倩楠;;聚乙烯醇優(yōu)勢(shì)降解酶的酶學(xué)特性分析[J];環(huán)境污染與防治;2011年07期

5 劉亞光;劉冰;李曉雨;李威;井秋月;何付麗;;異VA草松降解酶在不同條件下降解效果的比較研究[J];植物保護(hù);2014年01期

6 楊濤;馬美湖;;生物質(zhì)降解酶酶活的測(cè)定方法[J];中國釀造;2006年11期

7 王能強(qiáng);彭芳剛;梁芳;李會(huì)東;王棟;;聚乙烯醇降解酶酶解聚乙烯醇最優(yōu)條件研究[J];環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào);2010年07期

8 鄭青鳳;邵姍珊;李顥;趙曉祥;;多氯聯(lián)苯降解酶的分離純化及酶學(xué)性質(zhì)研究[J];湖北農(nóng)業(yè)科學(xué);2011年11期

9 王繼雯;甄靜;謝寶恩;劉瑩瑩;李冠杰;周伏忠;陳國參;;黑曲霉有機(jī)磷農(nóng)藥降解酶的純化及其性質(zhì)[J];江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào);2012年03期

10 徐冰潔;高品;薛罡;鄭博;胡金龍;;苯扎貝特降解酶活力檢測(cè)方法的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)研究[J];環(huán)境科學(xué)與技術(shù);2014年02期

中國重要會(huì)議論文全文數(shù)據(jù)庫 前5條

1 張穎;李寅;華兆哲;陳堅(jiān);;產(chǎn)聚乙烯醇降解酶的培養(yǎng)條件[A];康地恩杯第八屆全國染整前處理學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2009年

2 張穎;李寅;沈微;陳堅(jiān);;一株能產(chǎn)生聚乙烯醇降解酶的委內(nèi)瑞拉鏈霉菌[A];第一屆全國化學(xué)工程與生物化工年會(huì)論文摘要集(下)[C];2004年

3 黃敏;張春芳;;銅綠假單孢菌(Pseudomonas aeruginosa)苯甲酸鹽降解酶系統(tǒng)編碼基因ben區(qū)的轉(zhuǎn)座插入突變[A];中國細(xì)胞生物學(xué)學(xué)會(huì)第七次會(huì)議論文摘要匯編[C];1999年

4 韓文君;古靜燕;李俊剛;顧謙群;吳志紅;李越中;;海洋細(xì)菌Flammeovirga yaeyamensis MY04分泌型多糖降解酶的基因克隆與序列分析[A];2010年第四屆全國微生物遺傳學(xué)學(xué)術(shù)研討會(huì)論文摘要集[C];2010年

5 趙中濤;劉慧泉;安琳;王晨芳;許金榮;;真菌細(xì)胞壁降解酶組的比較基因組學(xué)分析[A];中國植物病理學(xué)會(huì)2012年學(xué)術(shù)年會(huì)論文集[C];2012年

中國重要報(bào)紙全文數(shù)據(jù)庫 前6條

1 叢秀明;有機(jī)磷農(nóng)藥降解酶制劑制成[N];中國化工報(bào);2006年

2 記者 王曉濤;我國研制成功國際領(lǐng)先的有機(jī)磷農(nóng)藥降解酶制劑[N];中國經(jīng)濟(jì)導(dǎo)報(bào);2006年

3 本報(bào)記者 王愛娥;有機(jī)磷農(nóng)藥降解酶制劑研制成功[N];農(nóng)資導(dǎo)報(bào);2006年

4 本報(bào)記者 趙引德;“比亞”降解酶破解農(nóng)藥殘留難題[N];農(nóng)資導(dǎo)報(bào);2006年

5 本報(bào)記者　胡其峰;有機(jī)磷農(nóng)藥降解酶制劑即將產(chǎn)業(yè)化[N];光明日?qǐng)?bào);2006年

6 ;高效農(nóng)藥降解酶面世[N];光明日?qǐng)?bào);2002年

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前6條

1 李凡;聚乳酸生物降解酶及其催化特性研究[D];山東大學(xué);2008年

2 翟逸;擬除蟲菊酯降解酶基因的克隆及酶學(xué)性質(zhì)研究[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2012年

3 宋金龍;煙嘧磺隆降解菌黃籃狀菌（Talaromyces flavus）的分離鑒定及降解機(jī)理研究[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2013年

4 江玉姬;有機(jī)磷農(nóng)藥降解菌的篩選及其降解酶特性[D];福建農(nóng)林大學(xué);2006年

5 湯鳴強(qiáng);三唑磷降解菌的分離鑒定及其降解酶特性的研究[D];福建農(nóng)林大學(xué);2012年

6 李康;降解毒死蜱的副球菌TRP菌株基因組測(cè)序、cpd基因的克隆及功能驗(yàn)證[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2012年

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 王義春;玉米赤霉烯酮降解酶高效分泌表達(dá)及其酶學(xué)特性研究[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2015年

2 姜春陽;微生物胞外聚合物在多環(huán)芳烴降解酶釋放過程中的作用[D];沈陽理工大學(xué);2015年

3 胡明;降解草甘膦米曲霉菌株的紫外誘變選育及其胞內(nèi)降解酶的酶學(xué)性質(zhì)分析[D];南昌大學(xué);2013年

4 周艷敬;玉米赤霉烯酮降解酶基因表達(dá)的啟動(dòng)子優(yōu)化研究[D];河南工業(yè)大學(xué);2015年

5 王開萍;嘔吐毒素降解菌的篩選鑒定、降解酶的純化及其特性研究[D];合肥工業(yè)大學(xué);2015年

6 吳迪;藻毒素降解酶家族的克隆表達(dá)及酶學(xué)性質(zhì)的研究[D];華中師范大學(xué);2014年

7 楊朋飛;伏馬毒素降解菌的機(jī)制解析及降解酶基因的克隆[D];河南工業(yè)大學(xué);2016年

8 陳芳霞;苦蕎蘆丁降解酶基因多態(tài)性分析和蛋白重組表達(dá)及催化特性分析[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2016年

9 宋朝霞;聚乙烯醇降解酶產(chǎn)生菌的篩選、發(fā)酵條件優(yōu)化及酶的初步應(yīng)用研究[D];江南大學(xué);2005年

10 程亮;脫氧雪腐鐮刀菌烯醇降解菌及降解酶的研究[D];河南工業(yè)大學(xué);2013年

，

本文編號(hào)：538481