本文關鍵詞：苦蕎蘆丁降解酶基因多態(tài)性分析和蛋白重組表達及催化特性分析

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【摘要】：苦蕎種子中含有高活性的蘆丁降解酶(Rutin Degrading Enzyme,RDE),蘆丁降解酶屬于β-D-糖苷酶家族,能夠降解蘆丁生成槲皮素和蕓香糖苷,是造成苦蕎面粉苦味的主要原因。本研究利用實驗室已克隆的蘆丁降解酶基因,設計引物擴增RDE基因組DNA,依據測序結果發(fā)現(xiàn)蘆丁降解酶在基因組上存在3種拷貝形式rde1、rde2、rde3,其中rde1為無內含子的基因形式,rde2和rde3為有內含子的基因形式,rde3由12個外顯子組成,rde2在rde3的第8外顯子處插入新的內含子形成了13個外顯子,兩者相比外顯子存在單堿基突變位點,內含子長度多態(tài)性是造成和兩者差異的主要原因。相同的是rde2和rde3內含子中的AT含量高達70%,兩者剪接位點堿基保守且遵循GT-AG規(guī)則。由此推測rde2和rde3可能為蘆丁降解酶同源基因。在基因結構分析的基礎上,構建rde真核重組表達載體pPICZαA-rde并轉化畢赤酵母SMD1168H宿主菌,1%甲醇誘導誘導表達48 h后,表達上清硫酸銨分級沉淀,80%的丙酮洗滌溶解后,DEAE-Sepharose CL 6B純化的蛋白經SDS-PAGE顯示分子量為75KDa,重組蘆丁降解酶(rRDE)分子量遠大于預期分子量,PNGase F消化后分子量遷移到54 KDa,表明重組表達蛋白為N-連接的糖蛋白。研究建立了快速純化苦蕎籽粒蘆丁降解酶的方法。利用蘆丁降解酶對有機溶劑高耐受性的典型特性,基于不同濃度的甲醇對蘆丁降解酶提取及活性的影響,結合非變性膠原位染色和酶活性分析確定蘆丁降解酶提取最適甲醇濃度為40%,即在乙酸緩沖液提取后加入終濃度為40%的甲醇去除雜蛋白,在pH4.0條件下,提取液經強陽離子層析柱SP-Sepharose HP一步純化得到分子量約為60 KDa的天然蘆丁降解酶(nRDE),純化效率可達70%左右。利用紫外分光光度計法對rRDE和nRDE的催化特性進行了比較分析,結果顯示兩者催化蘆丁降解的最適p H均為5.0,rRDE最適溫度為50℃,nRDE最適溫度為40℃,催化蘆丁的Km分別為5.375 mmol/L和11.333 mmol/L,nRDE的最大反應速率Vmax為是重組蛋白Vmax的10倍之多,推測不同來源蘆丁降解酶翻譯后修飾的不同是造成催化特性差異的主要原因。
【關鍵詞】：苦蕎 蘆丁降解酶 基因多態(tài)性 畢赤酵母 重組表達 催化特性
【學位授予單位】：西北農林科技大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：Q943.2
【目錄】：

• 摘要5-6
• abstract6-10
• 第一章 文獻綜述10-22
• 1.1 苦蕎簡介10
• 1.2 蘆丁的研究進展10-12
• 1.2.1 蘆丁的概況10
• 1.2.2 蘆丁的藥理研究進展10-12
• 1.3 降解蘆丁相關酶的研究進展12-17
• 1.3.1 α-L鼠李糖苷酶的研究進展12-13
• 1.3.2 β 糖苷酶的研究進展13-15
• 1.3.3 β 糖苷酶的底物特異性及催化機制的研究15-16
• 1.3.4 β 糖苷酶的分子研究和重組表達16-17
• 1.4 畢赤酵母表達系統(tǒng)17-18
• 1.5 基因多樣性形成的原因18-20
• 1.5.1 外顯子的改變18-19
• 1.5.2 內含子多樣性及其研究進展19-20
• 1.5.3 可變剪接（AS）20
• 1.6 展望20-21
• 1.7 研究目的意義21-22
• 第二章 蘆丁降解酶基因組DNA多態(tài)性分析22-28
• 2.1 實驗材料22
• 2.1.1 菌株22
• 2.1.2 工具酶與主要試劑22
• 2.2 實驗方法22-24
• 2.2.1 苦蕎基因組DNA提取22
• 2.2.2 引物設計22-23
• 2.2.3 RDE基因組DNA多態(tài)性克隆測序23
• 2.2.4 轉化子的篩選與鑒定23-24
• 2.2.5 測序鑒定24
• 2.3 實驗結果24-27
• 2.3.1 RDE基因組DNA克隆24-27
• 2.4 討論與分析27-28
• 第三章 一種快速純化苦蕎籽粒蘆丁降解酶的方法28-34
• 3.1 實驗材料28
• 3.2 實驗方法28-31
• 3.2.1 不同濃度甲醇溶劑對蘆丁降解酶粗酶液提取及活性的影響28-29
• 3.2.2 蘆丁降解酶粗酶液SDS-PAGE檢測29
• 3.2.3 Native-PAGE酶譜法檢測蘆丁降解酶的活性。29-30
• 3.2.4 紫外分光光度計法檢測蘆丁降解酶粗酶液活性30
• 3.2.5 蘆丁降解酶的提取方法優(yōu)化30
• 3.2.6 蘆丁降解酶的純化30-31
• 3.3 實驗結果與分析31-33
• 3.3.1 SDS-PAGE檢測不同濃度甲醇溶劑對蘆丁降解酶粗酶液提取的影響31
• 3.3.2 Native PAGE酶譜檢測不同濃度甲醇溶劑對蘆丁降解酶粗酶液活性的影響31-32
• 3.3.3 紫外分光光度計法檢測蘆丁降解酶粗酶液活性32
• 3.3.4 蘆丁降解酶的純化32-33
• 3.4 討論與分析33-34
• 第四章 蘆丁降解酶在畢赤酵母中的重組表達及純化34-41
• 4.1 實驗材料34
• 4.1.2 工具酶與主要試劑34
• 4.1.3 試劑配制34
• 4.2 實驗方法34-37
• 4.2.1 pPICZα A-rde分泌表達載體構建34-35
• 4.2.2 重組質粒轉化35-36
• 4.2.3 重組轉化子的表達分析36
• 4.2.4 目的蛋白純化36-37
• 4.2.5 重組蛋白糖基化分析及與天然蛋白大小比較分析37
• 4.3 結果與分析37-39
• 4.3.1 重組質粒的構建和鑒定37-38
• 4.3.2 轉化子PCR鑒定38
• 4.3.3 重組蛋白表達及純化分析38-39
• 4.3.4 重組蛋白糖基化分析及與天然蛋白大小比較分析39
• 4.4 討論與分析39-41
• 第五章 蘆丁降解酶的催化特性分析41-46
• 5.1 材料與試劑41
• 5.1.1 實驗材料41
• 5.1.2 主要試劑配制41
• 5.2 實驗方法41-42
• 5.2.1 RDE蛋白含量測定41
• 5.2.2 RDE酶活測定41-42
• 5.3 實驗結果42-44
• 5.3.1 不同反應時間對蘆丁降解酶活性的影響42
• 5.3.2 pH對酶活性的影響42-43
• 5.3.3 溫度對酶活性的影響43-44
• 5.3.4 RDE動力學參數Km和Vmax44
• 5.4 討論與分析44-46
• 第六章 結論與展望46-48
• 6.1 結論46
• 6.2 展望46-48
• 參考文獻48-56
• 附錄56-60
• 致謝60-61
• 作者簡介61

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