本文關鍵詞：IVM小鼠腦組織神經活動配-體受體互作用通路基因表達改變可導致父源性子二代基因表達異常

  更多相關文章： 未成熟卵體外培養(yǎng)技術 神經活動配體-受體相互作用通路 甲基化修飾 小鼠模型 傳代效應

【摘要】：目的：研究IVM小鼠F2代腦組織神經活動配體-受體相互作用(neuroactive ligand-receptor interaction)通路基因Gabra6, Glra1, Gria4, Grid2, Agtr2, Slpr5, Galr1, Grm4在IVM F2代的表達情況以揭示上述IVM F1代新生期異常表達基因的傳代效應,并進一步研究F2代中Glra1的甲基化狀況及相應的蛋白表達情況。材料和方法：1.利用近交系C57BL/6J小鼠,通過單純注射孕馬血清獲取未成熟卵,經體外成熟培養(yǎng)、ICSI輔助受精和胚胎移植等方法建立IVM小鼠模型。通過注射孕馬血清和人絨毛膜促性腺激素獲取成熟卵,經ICSI輔助受精和胚胎移植等方法建立VVM小鼠模型作為對照組,自然妊娠(natural conceived, NC)小鼠為陰性對照組。三組F1代新生小鼠各取一只處死后獲得腦組織運用Mouse Genome 430 2.0芯片進行腦組織全基因表達譜分析,并通過進一步的Pathway分析提示神經活動配體-受體相互作用通路中Gabra6, Glra1, Gria4, Grid2, Agtr2, Slpr5, Galr1, Grm4基因表達差異最為顯著。運用實時熒光定量PCR對上述F1代各組小鼠在新生及成年期都進行了驗證檢測,提示相比VVM組,IVM新生F1代雄雌小鼠中以上基因均出現(xiàn)了不同程度的上調,到成年后除IVM雌性小鼠Agtr2基因表達仍上調之外,其余的基因表達異常均得到糾正(具體數(shù)據詳見2010年浙江大學王寧博士畢業(yè)論文)。2.對上述F1代性成熟期各組雌雄小鼠兩兩1：1自然交配,得到相應的F2代。將F2代的類型分為IVM組[包括IVM(?)+NC(?) (MN), IVM(?)+IVM(?)(MM),NC(?)+ IVM(?)(NM)]、VVM組[包括VVM(?)+NC(?)(IN), VVM(?)VVM(?)(Ⅱ), NC(?)+VVM(?)(NI)]、NC組[NC(?)+NC(?)]三大組,包括七個小組,每小組8只相應F2代小鼠。其中以NC F2代小鼠為陰性對照組。3.出生的F2代小鼠飼養(yǎng)至10周時,進行水迷宮實驗,記錄各組小鼠的潛伏期及穿臺次數(shù)(該部分數(shù)據課題組先前已完成,數(shù)據暫未發(fā)表,各組間小鼠學習、認知能力未見明顯差異,具體數(shù)據詳見2010年浙江大學王寧博士畢業(yè)論文)后分別處死獲取各組小鼠的腦組織。4.通過熒光定量PCR技術,檢測10周各組小鼠腦組織的神經活動配體-受體相互作用通路中相關基因(Gabra6, Glra1, Gria4, Grid2, Agtr2, Slpr5, Galrl, Grm4)的表達。5.利用焦磷酸測序技術檢測10周各組小鼠Glra1各位點的甲基化情況。6.通過western-blot技術,檢測各組小鼠腦臟組織Glra1蛋白的表達。結果：1.IVM對F2代小鼠腦組織神經活動配體-受體相互作用通路各基因表達的影響與VVM組相比,IVM F2代小鼠10周時,腦組織中Glra1表達水平降低,差異具有統(tǒng)計學意義,其中以單一父源性因素影響最為明顯(MN組F2代Glra1表達量較IN組差異最為明顯)。各組間F2代小鼠腦組織Gria4, Grid2, Agtr2, Slpr5, Galr1, Grm4的表達差異無統(tǒng)計學意義。2.IVM對10周F2代小鼠腦組織Glra1甲基化修飾影響(1)比較NC組,IVMF2代小鼠腦組織Glra1的CpG2位點甲基化水平升高,差異具有統(tǒng)計學意義。與VVM小鼠F2代相比,甲基化水平也有升高,但未達差異的統(tǒng)計學意義。IVM小鼠腦組織Glra1的CpG6位點甲基化率相比VVM組及NC組均有顯著性升高,差異具有統(tǒng)計學意義。而小鼠腦組織Glra1其他CpG位點甲基化狀態(tài)三組間無統(tǒng)計學差異。(2)資料同時顯示,單一性父源性因素對F2代小鼠腦組織甲基化率影響最為明顯,在本研究進一步分析單純IVM父源性小鼠所生子代(MN組)中Glra1的甲基化狀態(tài)相比單純VVM父源性小鼠(IN組)在CpG1、CpG2位點明顯升高,差異具有統(tǒng)計學意義。3.IVM對F2代腦組織Glra1蛋白表達的影響相比NC組,10周IVMF2代小鼠腦組織Glra1蛋白表達水平降低,差異具有統(tǒng)計學意義。但相比VVM組無明顯統(tǒng)計學差異。其中從單一父源性因素對F2代Glra1蛋白表達的影響分析,通過對MN組和N組蛋白表達進行獨立t檢驗,結果表明單純IVM父源性小鼠所生子代(MN組)中Glra1的蛋白表達量較單純VVM父源性小鼠(IN組)降低,差異具有統(tǒng)計學意義。結論：1.IVM新生F1代父源性小鼠腦組織神經活動配體-受體相互作用通路基因異常表達可導致F2代腦組織中的Glra1基因表達異常。2.IVM新生F1代腦組織中神經活動配體-受體相互作用通路基因的表達異常雖然在其成年后大部分可以糾正,但IVMF2代中Glral的表達仍可出現(xiàn)異常,這可能是由于F1代中異常表觀修飾影響其雄性生殖系造成代間遺傳導致的。3.IVMF2代小鼠雖然在表型上未見明顯的神經系統(tǒng)及認知能力的發(fā)育差異,但存在潛在的神經系統(tǒng)疾病高發(fā)風險。尤其是父源性IVM F1代婚配可能對F2代的神經系統(tǒng)發(fā)育存在不良影響。
【關鍵詞】：未成熟卵體外培養(yǎng)技術 神經活動配體-受體相互作用通路 甲基化修飾 小鼠模型 傳代效應
【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R714.8
【目錄】：

• 致謝4-6
• 序言6-9
• 中文摘要9-12
• 英文摘要12-16
• 縮略詞表16-18
• 引言18-21
• 1 材料和方法21-24
• 2 實驗方法24-40
• 3 結果40-46
• 4 討論46-50
• 5 結論50-51
• 參考文獻51-55
• 綜述55-67
• 參考文獻61-67
• 作者簡介67

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