本文關(guān)鍵詞：青稞F7-OMT基因的克隆及表達(dá)分析

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【摘要】：青稞是青藏高原最有特色的作物,遺傳類型豐富多樣,具有“三高兩低”(高纖維、高蛋白、高維生素和低糖、低脂肪)的結(jié)構(gòu)組成和優(yōu)良的醫(yī)療保健功能。其類黃酮和β-葡聚糖等營養(yǎng)物質(zhì)豐富且顯著高于普通大麥。其中類黃酮化合物與其生殖生長、生態(tài)防御、抗脅迫、抗病菌等密切相關(guān)。F7-OMT (Flavonoid 7-O-methyltransferase)能催化底物類黃酮苯環(huán)上的一個或多個羥基甲基化產(chǎn)生氧甲基類黃酮。使類黃酮具有更強(qiáng)的脂溶性,更有利于在細(xì)胞內(nèi)的擴(kuò)散,提高植物的抗逆性；還能通過提高人體中的口服利用率,從而產(chǎn)生更強(qiáng)抗病、抗癌、調(diào)節(jié)糖脂代謝、保護(hù)心腦血管及神經(jīng)系統(tǒng)的作用。本研究以青稞“94-19-1”為材料,采用同源克隆和TA克隆的方法得到大量青稞F7-OMT基因片段,并進(jìn)行生物信息學(xué)分析；通過亞克隆構(gòu)建融合表達(dá)載體,對其誘導(dǎo)表達(dá)、優(yōu)化表達(dá)條件,并采用親和層析純化法得到純化蛋白；通過實時熒光定量PCR技術(shù)對F7-OMT在青稞和大麥高、低黃酮材料“94-19-1”、“肚里黃”、“揚農(nóng)啤6號”和“紅06-277”在UV和鹽脅迫處理下表達(dá)狀況進(jìn)行了相對定量分析。旨在為進(jìn)一步研究該酶蛋白功能和選育高抗性、高保健作用的青稞品種奠定基礎(chǔ)。主要結(jié)果如下：1.通過同源克隆方法得到青稞F7-OMT基因并進(jìn)行生物信息學(xué)分析表明：cDNA全長為1284 bp,其中包含開放閱讀框1173 bp。堿基分布均勻,密碼子偏愛性不強(qiáng),有20個稀有密碼子,GC含量不高,為53.03%。編碼390個氨基酸,蛋白分子質(zhì)量42207.8Da,分子式C1878H2977N497O562S22,等電點pI為5.36。在280 nm處摩爾消光系數(shù)為28420,半衰期為30 h,不穩(wěn)定系數(shù)為40.69,屬于不穩(wěn)定蛋白。脂肪系數(shù)為96.49,總平均親水性系數(shù)為0.127,屬于疏水性蛋白。無信號肽序列,無跨膜結(jié)構(gòu),但含有豐富的糖基化、磷酸化位點和3個二硫鍵。具有Methyltransf_2和Dimerization保守域,其His296為接受質(zhì)子的活性位點,而Asp258為SAM結(jié)合位點。通過NCBI-blastp同源序列比對發(fā)現(xiàn)OMT家族蛋白序列保守性較低,但在青稞F7-OMT氨基酸序列中His296對應(yīng)的組氨酸高度保守。系統(tǒng)發(fā)育樹分析表明,該蛋白與單子葉植物OMT歸為一類,與雙子葉OMT在進(jìn)化上有明顯區(qū)分,但其保守性沒有異黃酮O-甲基轉(zhuǎn)移酶(IOMT)強(qiáng),7-OMT家族并不是非常保守。2.通過亞克隆將F7-OMT基因連接到表達(dá)載體pET-32a上,構(gòu)建pET-32a-F7-OMT1融合表達(dá)載體,在E.coli BL21(DE3)pLysS中經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá),得到約60 kDa融合蛋白,同時通過時間及IPTG終濃度梯度優(yōu)化表達(dá)。并按IPTG濃度0.8 mmol/L、5 h條件誘導(dǎo)其蛋白大量表達(dá),從而采用親和層析純化法得到純化蛋白。3.采用相對熒光定量分析方法,以大麥組成型表達(dá)基因β-actin作為內(nèi)參,檢測到經(jīng)紫外線照射后,高黃酮含量青稞“94-19-1”和大麥“揚農(nóng)啤6號”的葉中高水平表達(dá),且前者顯著高于后者,后者根中也有一定量的表達(dá)。經(jīng)NaCl處理的材料葉、根中均發(fā)現(xiàn)表達(dá)水平極低。未經(jīng)處理的“94-19-1”葉中表達(dá)量不高,但其他材料卻表達(dá)量極低。
【關(guān)鍵詞】：大麥 青稞 F7-OMT基因 克隆 原核表達(dá)分析 熒光定量分析
【學(xué)位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S512.3;Q943.2
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-13
• 第一章 文獻(xiàn)綜述13-28
• 1 青稞概述13-14
• 2 類黃酮概述14-16
• 2.1 基本結(jié)構(gòu)14
• 2.2 功能14-15
• 2.3 分類15-16
• 3 植物氧甲基轉(zhuǎn)移酶(OMT)概述16-18
• 3.1 特點和功能16
• 3.2 分類16-18
• 3.2.1 按作用底物分類16-17
• 3.2.2 按分子量分類17-18
• 4 類黃酮氧甲基轉(zhuǎn)移酶(FOMT)概述18-25
• 4.1 催化機(jī)理18-21
• 4.1.1 底物選擇性18
• 4.1.2 結(jié)構(gòu)域18-19
• 4.1.3 與底物結(jié)合模式19-20
• 4.1.4 轉(zhuǎn)移甲基原理20-21
• 4.2 基本功能21-24
• 4.2.1 對植物的作用21-22
• 4.2.2 對動物及人體的作用22-24
• 4.3 類黃酮7-氧甲基轉(zhuǎn)移酶(F7-OMT)研究進(jìn)展24-25
• 5 研究技術(shù)路線、目的與意義25-28
• 5.1 技術(shù)路線25-26
• 5.2 目的與意義26-28
• 第二章 青稞F7-OMT基因克隆及生物信息學(xué)分析28-59
• 1 材料與方法28-38
• 1.1 材料28-30
• 1.1.1 植物材料28
• 1.1.2 菌株與載體28
• 1.1.3 主要試劑28
• 1.1.4 主要試劑配方28-29
• 1.1.5 主要儀器29-30
• 1.2 方法30-38
• 1.2.1 RNA提取30-31
• 1.2.2 RNA檢測31
• 1.2.2.1 濃度及純度測定31
• 1.2.2.2 完整性檢測31
• 1.2.3 cDNA第一鏈合成31-32
• 1.2.4 青稞F7-OMT基因的獲得32-33
• 1.2.4.1 引物設(shè)計32
• 1.2.4.2 PCR擴(kuò)增32-33
• 1.2.5 TA克隆33-35
• 1.2.5.1 目的片段的回收33-34
• 1.2.5.2 目的片段與載體連接34
• 1.2.5.3 連接載體的轉(zhuǎn)化34-35
• 1.2.5.4 陽性篩選35
• 1.2.6 生物信息學(xué)分析35-38
• 1.2.6.1 堿基序列分析35
• 1.2.6.2 CDS區(qū)密碼子分析35-36
• 1.2.6.3 氨基酸序列比對及保守域預(yù)測36
• 1.2.6.4 系統(tǒng)發(fā)育樹分析36
• 1.2.6.5 化性質(zhì)分析36
• 1.2.6.6 二級結(jié)構(gòu)預(yù)測36-37
• 1.2.6.7 信號肽預(yù)測37
• 1.2.6.8 跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測37
• 1.2.6.9 糖基化及磷酸化位點預(yù)測37
• 1.2.6.10 二硫鍵預(yù)測37
• 1.2.6.11 細(xì)胞定位37
• 1.2.6.12 三級結(jié)構(gòu)分析37-38
• 2 結(jié)果與分析38-55
• 2.1 總RNA濃度與純度檢測38-39
• 2.2 cDNA全長獲得39
• 2.3 重組質(zhì)粒菌液檢測39
• 2.4 生物信息學(xué)分析39-55
• 2.4.1 堿基序列分析39-42
• 2.4.2 CDS區(qū)密碼子分析42-44
• 2.4.3 氨基酸序列比對及保守域預(yù)測44-46
• 2.4.4 系統(tǒng)發(fā)育樹分析46-47
• 2.4.5 理化性質(zhì)分析47-48
• 2.4.6 二級結(jié)構(gòu)預(yù)測48-49
• 2.4.7 信號肽預(yù)測49
• 2.4.8 跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測49-50
• 2.4.9 糖基化及磷酸化位點預(yù)測50-52
• 2.4.10 二硫鍵預(yù)測52-53
• 2.4.11 細(xì)胞定位53
• 2.4.12 三級結(jié)構(gòu)分析53-55
• 3 討論55-59
• 3.1 青稞F7-OMT基因克隆55-56
• 3.2 生物信息學(xué)分析56-59
• 3.2.1 堿基序列及密碼子分析56
• 3.2.2 氨基酸序列及保守域分析56-57
• 3.2.3 系統(tǒng)發(fā)育樹分析57-58
• 3.2.4 蛋白性質(zhì)結(jié)構(gòu)分析58-59
• 第三章 青稞F7-OMT基因的原核表達(dá)59-74
• 1 材料與方法59-67
• 1.1 材料59-61
• 1.1.1 質(zhì)粒與菌株59
• 1.1.2 主要試劑59
• 1.1.3 主要試劑配方59-60
• 1.1.4 主要儀器60-61
• 1.2 方法61-67
• 1.2.1 帶雙酶切位點基因的獲得61
• 1.2.1.1 雙酶切引物設(shè)計61
• 1.2.1.2 PCR擴(kuò)增61
• 1.2.2 帶雙酶切位點基因的TA克隆61-62
• 1.2.3 原核表達(dá)系統(tǒng)的建立62-64
• 1.2.3.1 pMD19-T-F7-OMT1和pET-32a質(zhì)粒提取62
• 1.2.3.2 pMD19-T-F7-OMT1質(zhì)粒與pET-32a載體雙酶切62-63
• 1.2.3.3 酶切產(chǎn)物回收純化63
• 1.2.3.4 F-OMT與pET-32a載體連接63
• 1.2.3.5 重組子轉(zhuǎn)化E.coli DH5α63-64
• 1.2.3.6 重組子篩選64
• 1.2.3.7 pET-32a-F7-OMT1質(zhì)粒提取64
• 1.2.3.8 pET-32a-F7-OMT1質(zhì)粒轉(zhuǎn)化64
• 1.2.4 重組蛋白的融合表達(dá)64-66
• 1.2.4.1 IPTG誘導(dǎo)表達(dá)64-65
• 1.2.4.2 SDS-PAGE電泳檢測65-66
• 1.2.5 重組蛋白的親和層析純化66-67
• 2 結(jié)果67-72
• 2.1 重組子雙酶切檢測67-69
• 2.1.1 pMD19-T-F7-OMT1雙酶切檢測67
• 2.1.2 pET-32a-F7-OMT1雙酶切檢測67-69
• 2.2 融合表達(dá)分析69-71
• 2.2.1 IPTG誘導(dǎo)濃度梯度69-70
• 2.2.2 誘導(dǎo)表達(dá)時間梯度70-71
• 2.3 蛋白純化71-72
• 3 討論72-74
• 3.1 原核表達(dá)目的與意義72
• 3.2 表達(dá)系統(tǒng)選擇及條件優(yōu)化72-73
• 3.3 蛋白純化分析73-74
• 第四章 青稞F7-OMT基因相對定量分析74-82
• 1 材料與方法74-78
• 1.1 材料74-75
• 1.1.1 植物材料74
• 1.1.2 主要試劑74
• 1.1.3 主要試劑配制74
• 1.1.4 主要儀器74-75
• 1.2 方法75-78
• 1.2.1 植物材料水培75
• 1.2.2 植物材料處理75
• 1.2.3 RNA的提取75
• 1.2.4 第一鏈cDNA合成75-76
• 1.2.5 實時熒光定量PCR76-77
• 1.2.5.1 引物設(shè)計76-77
• 1.2.5.2 實時熒光定量PCR77
• 1.2.6 相對定量分析77-78
• 2 結(jié)果與分析78-80
• 2.1 融解曲線分析78-79
• 2.2 相對定量分析79-80
• 3 討論80-82
• 參考文獻(xiàn)82-92
• 致謝92-93
• 攻讀碩士期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文93

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：520457