本文關(guān)鍵詞：禽源腸炎沙門氏菌PmrB基因突變介導(dǎo)粘菌素耐藥機(jī)制研究

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【摘要】：禽源腸炎沙門氏菌是一種重要的人畜共患病原菌,可以通過食源性途徑傳染給人類。粘菌素(colistin)是一種常見的多肽類抗生素,目前是用于治療多重耐藥革蘭氏陰性菌感染最后的選擇。耐粘菌素腸炎沙門氏菌的出現(xiàn)及傳播給多重耐藥革蘭氏陰性菌的治療帶來了極大的威脅。有研究表明Pmr A/PmrB二元調(diào)控系統(tǒng)對(duì)革蘭氏陰性菌粘菌素耐藥的產(chǎn)生起到重要的作用。本實(shí)驗(yàn)室成功誘導(dǎo)出耐粘菌素腸炎沙門氏菌,對(duì)其PmrA、PmrB基因進(jìn)行測序,發(fā)現(xiàn)PmrB發(fā)生了不同于已有報(bào)道的突變,Pmr A基因并無變化。本研究在此發(fā)現(xiàn)的基礎(chǔ)上利用Red同源重組及I-Sce?酶構(gòu)建相應(yīng)的PmrB無痕突變菌株,研究突變前后菌株對(duì)粘菌素最小抑菌濃度(MIC),和粘菌素耐藥相關(guān)基因表達(dá)量變化,有助于了解禽源腸炎沙門氏菌Pmr A/PmrB突變對(duì)粘菌素耐藥的機(jī)制。主要的研究內(nèi)容及結(jié)果如下:利用粘菌素在2-12(32)菌株的基礎(chǔ)上繼續(xù)誘導(dǎo)耐藥,獲得2-12(512),利用高通量測序技術(shù)對(duì)2-12和2-12(512)菌株進(jìn)行全基因組測序。2-12和2-12(512)全基因組測序后進(jìn)行同源分析得2-12有5個(gè)特有蛋白,2-12(512)有9個(gè)特有蛋白;單核苷酸多態(tài)性(SNP)分析得2-12(512)與2-12比較有30個(gè)SNP位點(diǎn)。在輔助質(zhì)粒pKD46-rha-IS表達(dá)的Red同源重組系統(tǒng)及I-Sce?酶的作用下,利用基因突變重組片段197-cat-sacB、249-cat-sacB無痕且快速對(duì)腸炎沙門氏菌PmrB基因進(jìn)行突變,成功獲得了沙門氏菌PmrB基因突變株。測定構(gòu)建的PmrB基因缺失及點(diǎn)突變菌株對(duì)多種抗菌藥物(包括粘菌素)的MIC值,結(jié)果表明,突變后菌株對(duì)粘菌素的MIC值均為16μg/mL,是2-12敏感菌株粘菌素MIC的8倍。2-12ΔPIA與敏感菌相比對(duì)十二種常見抗生素敏感性無明顯變化;2-12D149N和2-12相比,慶大霉素(GM)MIC值提高160倍,大觀霉素(SPT)MIC值降低64倍,其余抗生素?zé)o明顯變化。通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng),測定腸炎沙門氏菌2-12、2-12ΔPIA、2-12 D149N、2-12(32)、2-12(512)、GD1-13、GD1-14與粘菌素耐藥相關(guān)的基因PmrA、PmrB、PmrC、PmrE、PmrH在mRNA水平上的表達(dá)量。結(jié)果顯示PmrB突變顯著的促進(jìn)了PmrA、PmrB、PmrC、PmrE、PmrH基因的表達(dá)。
【關(guān)鍵詞】：腸炎沙門氏菌 禽 PmrA/PmrB 同源重組 粘菌素
【學(xué)位授予單位】：華南農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S852.61
【目錄】：

• 摘要3-4
• ABSTRACT4-6
• 英文縮略詞或符號(hào)表6-9
• 1 前言9-18
• 1.1 粘菌素概述9
• 1.2 粘菌素結(jié)構(gòu)介紹9-10
• 1.3 粘菌素的作用機(jī)理10-11
• 1.4 沙門氏菌PmrA/PmrB二元調(diào)控系統(tǒng)概述11-12
• 1.5 PmrA/PmrB二元調(diào)控系統(tǒng)與粘菌素耐藥12-14
• 1.6 λRed重組14-17
• 1.7 本研究目的意義17-18
• 2 材料與方法18-36
• 2.1 引言18
• 2.2 材料18-21
• 2.2.1 菌株與質(zhì)粒18
• 2.2.2 主要試劑18-19
• 2.2.3 主要培養(yǎng)基及試劑的配制19-20
• 2.2.4 主要儀器20-21
• 2.2.5 引物設(shè)計(jì)與合成21
• 2.3 方法21-36
• 2.3.1 測定誘導(dǎo)耐藥保存菌株的MIC值并繼續(xù)誘導(dǎo)耐藥21-22
• 2.3.2 對(duì) 2-12和 2-12（512）沙門氏菌進(jìn)行全基因組測序22-23
• 2.3.3 重組片段的構(gòu)建23-29
• 2.3.4 pKD46-rha-IS質(zhì)粒的構(gòu)建29-30
• 2.3.5 重組菌株的構(gòu)建30-32
• 2.3.6 PmrB突變菌株粘菌素MIC測定32
• 2.3.7 PmrB突變菌株對(duì)12種常見抗菌藥的敏感性測定32-33
• 2.3.8 PmrA、PmrB基因及關(guān)聯(lián)基因的表達(dá)情況33-36
• 3 結(jié)果36-49
• 3.1 保存菌株的MIC值36
• 3.2 全基因組測序初步分析36-37
• 3.3 PCR擴(kuò)增重組片段37-39
• 3.3.1 cat及sacB基因擴(kuò)增37-38
• 3.3.2 cat和sacB融合PCR結(jié)果38-39
• 3.4 pKD46-rha-IS質(zhì)粒的構(gòu)建39-40
• 3.4.1 片段rha-IS的PCR擴(kuò)增39
• 3.4.2 pKD46質(zhì)粒用NcoI單酶切39
• 3.4.3 rha-IS片段和線性化pKD46做無縫克隆39-40
• 3.5 重組菌株的構(gòu)建40-44
• 3.5.1 質(zhì)粒pKD46-rha-IS電轉(zhuǎn)入 2-12鑒定40-41
• 3.5.2 第一次重組菌株鑒定41-42
• 3.5.3 第二次重組菌鑒定42-44
• 3.5.4 重組菌株丟失pKD46-rha-IS質(zhì)粒44
• 3.6 粘菌素最小抑菌濃度測定44-45
• 3.7 PmrB突變菌株對(duì)12種常見抗菌藥的敏感性45
• 3.8 PmrB及其關(guān)聯(lián)基因表達(dá)量情況45-49
• 4 討論49-52
• 4.1 突變位點(diǎn)的確認(rèn)49
• 4.2 突變菌株的構(gòu)建49-50
• 4.3 突變菌株對(duì)抗生素敏感性變化50
• 4.4 基因表達(dá)量變化50-52
• 全文總結(jié)52-53
• 致謝53-54
• 參考文獻(xiàn)54-57

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 董浩;吳清民;;布魯菌二元調(diào)控系統(tǒng)研究進(jìn)展[J];動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展;2013年08期

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本文編號(hào)：519897