本文關(guān)鍵詞：基于HPV18 E6E7基因的治療性疫苗的構(gòu)建及免疫原性研究

  更多相關(guān)文章： HPV18 E6E7 重組腺病毒疫苗 DC疫苗 CRISPR/Cas9系統(tǒng)

【摘要】：人乳頭瘤病毒是無包膜閉環(huán)雙鏈DNA病毒,許多癌癥如子宮頸癌、食管癌等的發(fā)生和發(fā)展都與HPV的感染有一定的關(guān)系。HPV目前已知有兩百多種亞型,大量研究發(fā)現(xiàn):高危型HPV16、HPV18在宮頸癌和食管癌病變組織中最為常見。HPV中的E6和E7是主要致癌蛋白,通過影響細胞周期、細胞凋亡等方面使宿主細胞永生化并惡性轉(zhuǎn)化。已發(fā)現(xiàn)E6、E7蛋白在大多數(shù)腫瘤組織及癌前病變組織中持續(xù)表達,在正常組織中卻不表達,因此E6、E7蛋白可被選擇作為發(fā)展HPV相關(guān)腫瘤治療性疫苗的理想靶抗原。但是E6、E7基因?qū)儆诎┗?直接用作抗原基因構(gòu)建治療性疫苗,存在較大程度的安全性隱患。已有大量研究表明,通過對癌基因E6、E7關(guān)鍵位點進行密碼子突變,可以降低甚至消除E6、E7基因的致癌性,從而提高E6、E7蛋白作為治療性疫苗靶抗原的安全性。樹突狀細胞(Dendritic cell,DC)是免疫系統(tǒng)中目前所知的功能最強大的抗原提呈細胞,捕捉抗原,通過MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ兩種途徑將抗原遞交給T細胞,從而激活T細胞,誘導機體產(chǎn)生體液免疫和細胞免疫。國內(nèi)外已有大量關(guān)于DC疫苗的應用報道。本研究首先構(gòu)建攜帶HPV18 E6E7野生型基因的重組腺病毒疫苗rAd-HPV18 E6E7-0及其DC疫苗,攜帶HPV18 E6E7優(yōu)化融合突變基因的重組腺病毒疫苗rAd-HPV18 E6E7-3及其DC疫苗(其中對E6第138位氨基酸和E7第98位氨基酸進行突變,即C138G和C98G),然后免疫小鼠,獲取T淋巴細胞,用ELISPOT技術(shù)檢測各疫苗組的細胞免疫原性。結(jié)果顯示基于HPV18 E6E7基因治療性疫苗可以產(chǎn)生顯著的細胞免疫效果,從而為進一步開發(fā)HPV18相關(guān)腫瘤治療性疫苗打下基礎(chǔ)。最后本研究構(gòu)建了重組慢病毒載體質(zhì)粒LentiCRISPR-v2-HPV16/18 E6E7,期望通過CRISPR/Cas9系統(tǒng)敲除HPV 16/18 E6E7基因,探索一種靶向治療HPV相關(guān)腫瘤的新型方法。
【關(guān)鍵詞】：HPV18 E6E7 重組腺病毒疫苗 DC疫苗 CRISPR/Cas9系統(tǒng)
【學位授予單位】：北京工業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R392
【目錄】：

• 摘要4-5
• Abstract5-6
• 主要英文縮寫詞6-10
• 第1章 緒論10-20
• 1.1 HPV研究背景10-13
• 1.1.1 HPV分子特點10-11
• 1.1.2 HPV與腫瘤的關(guān)系11-12
• 1.1.3 HPV致癌機制12-13
• 1.2 HPV相關(guān)腫瘤的治療13-17
• 1.2.1 腫瘤治療的傳統(tǒng)方法13-14
• 1.2.2 腫瘤治療新技術(shù)14-16
• 1.2.3 CRISPR/Cas9在HPV相關(guān)腫瘤治療中的應用前景16-17
• 1.3 課題研究內(nèi)容17-20
• 1.3.1 攜帶HPV18 E6E7基因的腺病毒疫苗及DC疫苗的構(gòu)建及免疫原性研究17-18
• 1.3.2 CRISPR/Cas9敲除HPV16/18 E6E7基因的質(zhì)粒構(gòu)建18-20
• 第2章 攜帶HPV18 E6E7基因的腺病毒疫苗及DC疫苗的構(gòu)建及免疫原性研究20-38
• 2.1 引言20
• 2.2 實驗材料20-22
• 2.2.1 實驗試劑20-21
• 2.2.2 實驗設(shè)備21
• 2.2.3 菌株和質(zhì)粒21-22
• 2.2.4 細胞株22
• 2.2.5 實驗動物22
• 2.3 實驗方法22-32
• 2.3.1 重組腺病毒疫苗rAd-HPV18 E6E7的制備22-28
• 2.3.2 樹突狀細胞疫苗DC-HPV18 E6E7的制備28-29
• 2.3.3 重組腺病毒疫苗及樹突狀細胞疫苗的免疫原性檢測29-32
• 2.4 實驗結(jié)果32-36
• 2.4.1 穿梭質(zhì)粒pDC315-HPV18 E6E7酶切鑒定32
• 2.4.2 骨架質(zhì)粒pBH Glox E1△\3 cre的酶切鑒定結(jié)果32-33
• 2.4.3 檢測重組腺病毒疫苗E6E7的表達33
• 2.4.4 純化重組腺病毒的滴度測定33-34
• 2.4.5 重組腺病毒感染DC的條件34-35
• 2.4.6 Western Blot檢測樹突狀細胞疫苗E6E7表達35
• 2.4.7 ELISPOT檢測細胞免疫反應35-36
• 2.5 討論36
• 2.6 本章小結(jié)36-38
• 第3章 CRISPR/Cas9敲除HPV 16/18 E6E7基因的質(zhì)粒構(gòu)建38-48
• 3.1 引言38
• 3.2 實驗材料38-39
• 3.2.1 實驗設(shè)備38-39
• 3.2.2 菌株和質(zhì)粒39
• 3.2.3 工具和內(nèi)切酶39
• 3.3 實驗方法39-42
• 3.3.1 gRNA序列的設(shè)計與合成39-40
• 3.3.2 寡核苷酸退火連接40
• 3.3.3 載體質(zhì)粒lentiCRISPR-V2酶切及膠回收40-41
• 3.3.4 連接目的片段與載體41
• 3.3.5 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化41
• 3.3.6 連接產(chǎn)物的提取及鑒定41-42
• 3.4 實驗結(jié)果42-45
• 3.4.1 慢病毒質(zhì)粒lentiCRISPR-V2酶切結(jié)果42
• 3.4.2 慢病毒質(zhì)粒lentiCRISPR-V2膠回收結(jié)果42
• 3.4.3 重組質(zhì)粒測序鑒定結(jié)果42-45
• 3.5 討論45
• 3.6 本章小結(jié)45-48
• 結(jié)論48-50
• 參考文獻50-56
• 攻讀碩士學位期間所發(fā)表的學術(shù)論文56-58
• 致謝58

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