本文關(guān)鍵詞：齊口裂腹魚GK基因時空表達(dá)及其影響初步研究

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【摘要】：葡萄糖激酶(GK)是糖酵解過程中的限速酶,為了更好的了解齊口裂腹魚GK的分子特點及調(diào)控作用,本研究運用RACE技術(shù)首次克隆了齊口裂腹魚(Schizothorax prenanti)的GK基因cDNA全序列；運用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測了GK基因在成魚、產(chǎn)后親魚中的組織分布,測定了同一親本的胚胎及胚后發(fā)育過程中GK基因表達(dá)時序；研究了不同開口餌料和灌服不同糖對齊口裂腹魚GK基因表達(dá)的影響。齊口裂腹魚GK基因cDNA全序列共2087bp (GenBank登陸號：KT895594.1),其中5'-UTR為63bp,3'-UTR為593bp,ORF為1431bp,編碼476個氨基酸,其中包括1個葡萄糖激酶特有結(jié)構(gòu)域序列、ATP結(jié)合位點以及葡萄糖結(jié)合位點。齊口裂腹魚GK的氨基酸序列與鯉魚(Cyprinus carpio)、彭澤鯽(Carassius auratus var. Pengze)和草魚(Ctenopharyngodon idella)的同源性分別高達(dá)到97.9%、97.3%和96.8%。齊口裂腹魚GK基因分布具有高度的組織特異性。成魚的19個組織中,肝胰臟表達(dá)量最高,其次為心臟、卵巢和精巢,其余組織表達(dá)量很低。產(chǎn)后親魚16個組織中也是肝胰臟表達(dá)量最高(雌魚高于雄魚),但心臟、卵巢和精巢等其余組織表達(dá)量極低。繁殖過程對GK基因的組織分布有明顯影響。齊口裂腹魚同一親本子代的26個胚胎時期和10個胚后時期中,GK基因的表達(dá)時序特征分明,且胚后階段的表達(dá)水平總體高于胚胎階段。GK基因于未受精卵中有表達(dá),至4細(xì)胞期(82.2℃·h)時差異不顯著,8細(xì)胞期(104.7℃·h)時開始上調(diào),到16細(xì)胞期(127.5℃·h)時達(dá)到最高,然后下降,到囊胚早期(225.3℃·h)其表達(dá)量與未受精卵相近,表達(dá)量再次上升并于原腸胚早期(684.7℃·h)之后下降,但于心臟原基出現(xiàn)(1619.2℃·h)時表達(dá)量出現(xiàn)小高峰,至出膜前期(2154.7℃·h)低于未受精卵表達(dá)水平。GK基因表達(dá)水平在初孵仔魚中較低,于循環(huán)期(4034.5℃·h)顯著增加,到體色素出現(xiàn)期(4406.5℃·h)時又顯著下降,此后表達(dá)量不斷上調(diào),到消化道貫通(6278.5℃·h)時最高,此時仔魚平游覓食,能量消耗增加,而后GK又開始下調(diào),于鱗片形成時仍高于未受精卵水平。GK基因高表達(dá)與胚胎、胚后發(fā)育過程中重要器官的形成和高能耗有關(guān)。本研究結(jié)果可為進(jìn)一步研究GK基因在齊口裂腹魚整個生命周期中的作用奠定基礎(chǔ)。蛋黃、鹵蟲卵、微粒飼料對齊口裂腹魚仔魚GK酶活力及基因表達(dá)的影響出現(xiàn)差異。3d時各餌料組的GK酶活力和基因表達(dá)量差異不顯著,說明卵黃囊的存在會減小餌料對GK酶活力及基因表達(dá)的影響；3d至30d時鹵蟲卵組和微粒飼料組的GK基因表達(dá)量隨養(yǎng)殖時間的增加不斷提高,而蛋黃組GK基因表達(dá)量基本不變(除10d時略高)。仔魚生長速度快,其GK基因表達(dá)量高,并隨養(yǎng)殖時伺增加而提高,但基因表達(dá)量與酶活力之間未反映出一致關(guān)系。灌服葡萄糖和可溶性淀粉后1h時不會影響齊口裂腹魚肝胰臟中GK的酶活力和基因表達(dá)量變化,1h后會誘導(dǎo)二者提高,24h時基本恢復(fù)灌服前水平,且葡萄糖效應(yīng)時間更短,說明24h內(nèi)魚體對葡萄糖的糖酵解效率高于可溶性淀粉。灌服葡萄糖會抑制肝胰臟中PEPCK的酶活力和基因表達(dá)量,但不會抑制中腎、前腸和后腸中PEPCK基因的表達(dá)。本研究結(jié)果可為闡明齊口裂腹魚糖代謝本質(zhì)提供一定的理論依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：齊口裂腹魚 GK基因 時空表達(dá) 開口餌料
【學(xué)位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S917.4
【目錄】：

• 摘要3-5
• Abstract5-8
• 符號說明8-12
• 前言12-13
• 1 文獻(xiàn)綜述13-26
• 1.1 魚類糖代謝概況14-18
• 1.1.1 糖代謝主要途徑14-15
• 1.1.2 糖代謝主要場所15-16
• 1.1.3 糖代謝能力16-17
• 1.1.4 糖代謝關(guān)鍵酶17-18
• 1.2 魚類GK基因的研究進(jìn)展18-24
• 1.2.1 GK的發(fā)現(xiàn)與基因克隆18-19
• 1.2.2 GK基因的分布19-20
• 1.2.3 生物學(xué)功能與調(diào)控20-22
• 1.2.4 糖類對魚類GK、PEPCK的影響22-24
• 1.2.5 小結(jié)24
• 1.3 本研究的目的意義及研究內(nèi)容24-26
• 1.3.1 目的意義24-25
• 1.3.2 研究內(nèi)容25-26
• 2 齊口裂腹魚GK基因cDNA全長序列的克隆26-44
• 2.1 試驗材料26-27
• 2.1.1 試驗魚26
• 2.1.2 主要試劑26
• 2.1.3 主要儀器26-27
• 2.1.4 主要試劑配制27
• 2.2 試驗方法27-35
• 2.2.1 組織采樣27-28
• 2.2.2 總RNA的提取及檢測28-29
• 2.2.3 制備cDNA29
• 2.2.4 核心序列的克隆29-32
• 2.2.5 RACE擴(kuò)增32-34
• 2.2.6 全長序列的拼接34
• 2.2.7 生物信息學(xué)分析34-35
• 2.3 試驗結(jié)果35-43
• 2.3.1 組織總RNA質(zhì)量檢測35
• 2.3.2 GK基因的cDNA全序列35-36
• 2.3.3 氨基酸序列分析36-38
• 2.3.4 同源性和系統(tǒng)進(jìn)化分析38-43
• 2.4 討論43-44
• 3 齊口裂腹魚GK基因的時空表達(dá)44-58
• 3.1 試驗材料44-45
• 3.1.1 成魚和產(chǎn)后親魚44
• 3.1.2 胚胎44
• 3.1.3 主要試劑44
• 3.1.4 主要儀器44-45
• 3.2 試驗方法45-50
• 3.2.1 組織取樣45
• 3.2.2 不同發(fā)育時期胚胎及仔魚取樣45-48
• 3.2.3 總RNA提取及檢測48
• 3.2.4 制備cDNA模板48
• 3.2.5 實時熒光定量PCR48-49
• 3.2.6 數(shù)據(jù)分析49-50
• 3.3 試驗結(jié)果50-55
• 3.3.1 引物質(zhì)量檢測結(jié)果50-51
• 3.3.2 GK基因在齊口裂腹魚成魚、產(chǎn)后親魚中的組織分布51-53
• 3.3.3 GK基因在齊口裂腹魚胚胎及胚后發(fā)育過程中的表達(dá)情況53-55
• 3.4 討論55-58
• 3.4.1 GK基因在齊口裂腹魚成魚、產(chǎn)后親魚中的組織特異性55-57
• 3.4.2 GK基因在齊口裂腹魚胚胎及胚后發(fā)育過程中的表達(dá)分析57-58
• 4 不同開口餌料對齊口裂腹魚GK酶活力及基因表達(dá)量的影響58-66
• 4.1 試驗材料58-59
• 4.1.1 試驗魚58
• 4.1.2 開口餌料58
• 4.1.3 主要試劑58
• 4.1.4 主要儀器58-59
• 4.2 試驗方法59-60
• 4.2.1 飼養(yǎng)管理59
• 4.2.2 試驗分組及取樣59
• 4.2.3 指標(biāo)測定59-60
• 4.2.4 數(shù)據(jù)分析60
• 4.3 試驗結(jié)果60-62
• 4.3.1 GK酶活力60-61
• 4.3.2 GK基因表達(dá)量61-62
• 4.4 討論62-66
• 4.4.1 不同開口餌料對仔魚GK酶活力的影響62-64
• 4.4.2 不同開口餌料對仔魚GK基因表達(dá)量的影響64-66
• 5 灌服葡萄糖和可溶性淀粉對GK、PEPCK酶活力及基因表達(dá)量的影響66-83
• 5.1 試驗材料66
• 5.1.1 試驗魚66
• 5.1.2 主要試劑66
• 5.1.3 主要儀器66
• 5.1.4 主要試劑配制66
• 5.2 試驗方法66-68
• 5.2.1 飼養(yǎng)管理66-67
• 5.2.2 試驗分組及取樣67
• 5.2.3 指標(biāo)測定67-68
• 5.2.4 數(shù)據(jù)分析68
• 5.3 試驗結(jié)果68-78
• 5.3.1 肝糖原68-69
• 5.3.2 GK酶活力69-70
• 5.3.3 PEPCK酶活力70-71
• 5.3.4 GK基因表達(dá)量71-73
• 5.3.5 PEPCK基因表達(dá)量73-78
• 5.4 討論78-83
• 5.4.1 不同糖對齊口裂腹魚肝糖原的影響78-79
• 5.4.2 不同糖對齊口裂腹魚GK、PEPCK酶活力的影響79-80
• 5.4.3 不同糖對齊口裂腹魚GK、PEPCK基因表達(dá)量的影響80-83
• 6 主要結(jié)論83-84
• 參考文獻(xiàn)84-93
• 致謝93-94
• 攻讀學(xué)位期間完成的學(xué)術(shù)成果目錄94

【參考文獻(xiàn)】

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