本文關(guān)鍵詞：日本牙鲆Paralichthys olivaceus核酸內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域1基因的克隆與表征，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：日本牙鲆(Paralichthys olivaceus)是東亞國(guó)家如中國(guó)、日本和韓國(guó)沿海養(yǎng)殖中重要的魚種之一。其全球養(yǎng)殖產(chǎn)量在過(guò)去20年內(nèi)呈快速增長(zhǎng)。隨著養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展,日本牙鲆在養(yǎng)殖中面臨易受病原體感染的嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。因此,更好的了解其免疫系統(tǒng)有助于對(duì)抗其魚類疾病并促進(jìn)日本牙鲆養(yǎng)殖業(yè)的進(jìn)一步發(fā)展。魚類免疫系統(tǒng)可分為先天性免疫系統(tǒng)和獲得性免疫系統(tǒng),也可分別稱為非特異性免疫系統(tǒng)和特異性免疫系統(tǒng)。先天性免疫系統(tǒng)屬于整個(gè)免疫系統(tǒng)的亞系統(tǒng)部分,保護(hù)機(jī)體不受其它生物的感染。它以一種籠統(tǒng)并迅速的方式識(shí)別入侵的病原體并對(duì)其產(chǎn)生應(yīng)答。先天性免疫對(duì)多細(xì)胞生物的生存是至關(guān)重要的,但它不能為機(jī)體提供長(zhǎng)效的保護(hù)性免疫。獲得性免疫由高度特異性細(xì)胞,蛋白和通路組成,為機(jī)體提供長(zhǎng)效且高度的特異性保護(hù)。先天性免疫系統(tǒng)可分為物理、細(xì)胞和體液成分。體液成分包括生長(zhǎng)抑制因子、分解酶、天然抗體、細(xì)胞因子、趨化因子和抗菌肽等。核酸內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域1(ENDOD1)蛋白是古老的DNA/RNA非特異性核酸酶家族成員之一。該家族的核酸酶已在許多原核和真核生物中被發(fā)現(xiàn),他們擁有以下共同特性:可切割DNA和RNA,即切割雙鏈和單鏈核酸,且反應(yīng)需要二價(jià)離子如Mg2+的參與。在實(shí)驗(yàn)室前期工作中,利用微陣列技術(shù)檢測(cè)了福爾馬林殺死的遲鈍愛(ài)德華氏菌(E.tarda FKC)注射不同時(shí)間段后日本牙鲆中各基因的表達(dá)情況。其中發(fā)現(xiàn),來(lái)自日本牙鲆的ENDOD1基因(Jf_ENDOD1)在E.tarda FKC注射魚體6h及12h后,與正常魚體相比,其表達(dá)量均有明顯提高。因此推測(cè)Jf_ENDOD1的表達(dá)或許與牙鲆的免疫反應(yīng)存在一定關(guān)系。本研究中,利用RACE-PCR技術(shù)擴(kuò)增得到Jf_ENDOD1的cDNA序列。經(jīng)分析,其cDNA序列包含一個(gè)912bp的開(kāi)放閱讀框,編碼303個(gè)氨基酸。起始的27個(gè)氨基酸被預(yù)測(cè)為Jf_ENDOD1的一個(gè)信號(hào)肽序列。成熟的Jf_ENDOD1由276個(gè)氨基酸組成,其預(yù)測(cè)蛋白分子量為32kDa。經(jīng)比對(duì),日本牙鲆Jf_ENDOD1的氨基酸序列與大黃魚Larimichthys crocea的預(yù)測(cè)序列相似度達(dá)76%。在Jf_ENDOD1組織分布特異性檢測(cè)中,發(fā)現(xiàn)在所有被檢測(cè)的健康魚體組織中,Jf_ENDOD1 mRNA均有少量分布,而在注射E.tarda FKC 6h后的魚體組織中,Jf_ENDOD1 mRNA在腦、腎、脾和腸組織中大量表達(dá),在腮和皮膚組織中呈中度表達(dá),而在肌肉和肝臟組織中未見(jiàn)明顯變化。本研究還利用大腸桿菌Escherichia coli生產(chǎn)Jf_ENDOD1重組蛋白,且經(jīng)檢測(cè),該重組蛋白具有DNase活性。此外,為了評(píng)估Jf_ENDOD1蛋白的體內(nèi)活性,本研究收集了E.tarda FKC注射日本牙鲆12h,24h及72h后脾和腎組織的總蛋白并同時(shí)采集相同組織的mRNA。檢測(cè)發(fā)現(xiàn),注射組的總蛋白DNase活性均高于正常組,且注射組的Jf_ENDOD1 mRNA表達(dá)量明顯高于正常組,故推測(cè),注射組的總蛋白DNase活性升高源于Jf_ENDOD1表達(dá)量升高。
【關(guān)鍵詞】：日本牙鲆 免疫反應(yīng) 核酸酶 ENDOD1
【學(xué)位授予單位】：浙江海洋大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S917.4
【目錄】：

• 摘要8-10
• ABSTRACT10-14
• 第一章 文獻(xiàn)綜述14-24
• 1.1 日本牙鲆14
• 1.2 魚類先天性免疫14-20
• 1.3 中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)（NETs）20-21
• 1.4 非特異性核酸內(nèi)切酶21-23
• 1.5 目的23-24
• 第二章 Jf_ENDOD1 cDNA克隆與序列分析24-34
• 2.1 材料與方法24-28
• 2.1.1 實(shí)驗(yàn)材料24
• 2.1.2 總RNA提取24
• 2.1.3 RACE-PCR合成Jf_ENDOD1 cDNA 5’端片段24-25
• 2.1.4 分段測(cè)序獲得Jf_ENDOD1 cDNA序列25-28
• 2.1.5 Jf_ENDOD1序列分析28
• 2.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果28-32
• 2.2.1 Jf_ENDOD1基因cDNA克隆及序列分析28-30
• 2.2.2 多重序列比對(duì)及系統(tǒng)分析30-32
• 2.3 討論32-34
• 第三章 Jf_ENDOD1組織分布特異性分析34-38
• 3.1 材料與方法34-35
• 3.1.1 實(shí)驗(yàn)材料34
• 3.1.2 總RNA提取34
• 3.1.3 cDNA合成34-35
• 3.1.4 RT-PCR擴(kuò)增各組織Jf_ENDOD1及內(nèi)控基因35
• 3.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果35-36
• 3.3 討論36-38
• 第四章 Jf_ENDOD1重組質(zhì)粒構(gòu)建及蛋白純化38-45
• 4.1 材料與方法38-43
• 4.1.1 實(shí)驗(yàn)材料38
• 4.1.2 重組菌構(gòu)建38-41
• 4.1.3 重組蛋白純化及復(fù)性41-42
• 4.1.4 SDS-PAGE檢測(cè)重組蛋白42-43
• 4.1.5 Western-blotting檢測(cè)重組蛋白43
• 4.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果43-44
• 4.3 討論44-45
• 第五章 重組蛋白及魚總蛋白DNase活性分析45-51
• 5.1 材料與方法45-47
• 5.1.1 實(shí)驗(yàn)材料45
• 5.1.2 RT-PCR檢測(cè)Jf_ENDOD1 mRNA表達(dá)量45-46
• 5.1.3 總蛋白提取46
• 5.1.4 DNase活性試驗(yàn)46-47
• 5.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果47-49
• 5.3 討論49-51
• 結(jié)論51-52
• 參考文獻(xiàn)52-69
• 致謝69-70
• 在讀期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文及研究成果70

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