本文關(guān)鍵詞：MGMT基因在血小板特異性表達(dá)F9基因治療血友病B中的應(yīng)用研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的：在靶向血小板的血友病B基因治療中,慢病毒體外轉(zhuǎn)導(dǎo)的造血干細(xì)胞經(jīng)骨髓移植進(jìn)入受體小鼠體內(nèi)。慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)還很難做到100%造血干細(xì)胞都有效轉(zhuǎn)入了目的基因,同時(shí)在骨髓移植中,雖然受體小鼠經(jīng)過(guò)輻照處理以清除自身的骨髓造血干細(xì)胞,但也不能保證100%的細(xì)胞清除率,而異體細(xì)胞與自身細(xì)胞相比總是會(huì)處于競(jìng)爭(zhēng)的劣勢(shì)。因此在治療后小鼠體內(nèi)只有一部分造血干細(xì)胞成功地表達(dá)了目的基因,這將影響目的基因的表達(dá)水平和長(zhǎng)期表達(dá)穩(wěn)定性。為提高目的基因的表達(dá)水平,幫助移植的細(xì)胞在受體內(nèi)重建,本文研究?jī)?nèi)容為探索通過(guò)藥物篩選基因MGMT(P140K)進(jìn)行體內(nèi)外藥物篩選的方法進(jìn)一步提高造血干細(xì)胞移植比例及FIX的表達(dá)水平。方法：我們從人肝細(xì)胞中克隆了MGMT基因,以定點(diǎn)突變的方法將MGMT第140位的脯氨酸(ccc)突變?yōu)橘?lài)氨酸(AAG)得到藥物篩選基因MGMT(P140K),在2bF9-LV表達(dá)載體中插入藥物篩選基因MGMT(P140K),構(gòu)建成含有MGMT(P140K)基因的FIX病毒載體2bF9-LV(MGMT)。亞硝基類(lèi)化療藥物卡氮芥(BCNU)和O6-BG合并處理造血干細(xì)胞,則只有轉(zhuǎn)移并表達(dá)了MGMT(P140K)基因的細(xì)胞可以存活下來(lái),其他細(xì)胞將被殺死。通過(guò)體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn),利用MGMT(P140K)、BCNU和06-BG就可以實(shí)現(xiàn)對(duì)轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的高效篩選。結(jié)果：成功構(gòu)建了pWPT2bF9-MGMT (P140K)表達(dá)載體,并用這個(gè)載體制備了慢病毒載體2bF9-MGMT (P140K)-LV,同時(shí)也制備了一個(gè)GFP慢病毒載體GFP-LV,慢病毒的滴度達(dá)到109拷貝/ml,GFP-LV在293T細(xì)胞和Dami細(xì)胞中高表達(dá)。以2bF9-MGMT (P140K)-LV感染Dami細(xì)胞,2bF9可表達(dá)產(chǎn)生FIX,在此基礎(chǔ)上進(jìn)行藥物篩選也初見(jiàn)成效。結(jié)論：我們以慢病毒包裝體系成功地包裝生產(chǎn)了兩個(gè)病毒載體GFP-LV和2bF9-MGMT (P140K)-LV。通過(guò)GFP-LV在293T細(xì)胞和Dami細(xì)胞成功表達(dá)證明了慢病毒包裝體系可生產(chǎn)質(zhì)量可靠穩(wěn)定的慢病毒。我們建立了針對(duì)MGMT的藥物篩選體系,2bF9-MGMT (P140K)-LV感染細(xì)胞后可表達(dá)產(chǎn)生FIX,且針對(duì)MGMT的藥物篩選實(shí)驗(yàn)證明了MGMT (P140K)的表達(dá)和功能；并通過(guò)病毒感染骨髓細(xì)胞,經(jīng)過(guò)藥物篩選在一定程度上體現(xiàn)出：體外藥物篩選能夠提高骨髓移植中轉(zhuǎn)基因的效率。
【關(guān)鍵詞】：基因治療 血友病B 慢病毒 MGMT基因 藥物篩選
【學(xué)位授予單位】：杭州師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R554.1
【目錄】：

• 致謝5-9
• 中文摘要9-10
• 英文摘要10-12
• 英文縮略詞12-13
• 第一章 序言13-16
• 第二章 實(shí)驗(yàn)材料和方法16-38
• 2.1 主要實(shí)驗(yàn)試劑16-17
• 2.2 實(shí)驗(yàn)材料17
• 2.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)備17-18
• 2.4 實(shí)驗(yàn)方法18-38
• 2.4.1 質(zhì)粒構(gòu)建18-27
• 2.4.1.1 野生型MGMT cDNA的克隆18-22
• 2.4.1.2 MGMT定點(diǎn)突變22-23
• 2.4.1.3 MGMT(P140K)與CMV啟動(dòng)子連接23-24
• 2.4.1.4 構(gòu)建表達(dá)載體pWPT2bF9-MGMT24-27
• 2.4.2 細(xì)胞培養(yǎng)27-29
• 2.4.2.1 293T細(xì)胞培養(yǎng)27
• 2.4.2.2 Dami細(xì)胞培養(yǎng)27
• 2.4.2.3 小鼠造血干細(xì)胞的收集與培養(yǎng)27-29
• 2.4.3 慢病毒制備29-34
• 2.4.3.1 質(zhì)粒宏量抽提29-30
• 2.4.3.2 磷酸鈣法制備慢病毒30
• 2.4.3.3 慢病毒顆粒數(shù)測(cè)定30-32
• 2.4.3.4 慢病毒整合數(shù)測(cè)定32-34
• 2.4.4 慢病毒感染細(xì)胞實(shí)驗(yàn)34-35
• 2.4.4.1 感染293T細(xì)胞34
• 2.4.4.2 感染Dami細(xì)胞34-35
• 2.4.5 MGMT(P140K)功能測(cè)定實(shí)驗(yàn)35-36
• 2.4.5.1 不同濃度BCNU對(duì)細(xì)胞的殺傷作用36
• 2.4.5.2 MGMT(P140K)對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用36
• 2.4.6 FIX ELISA36-38
• 第三章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果38-48
• 3.1 載體的構(gòu)建與鑒定38-41
• 3.1.1 MGMT cDNA的克隆38
• 3.1.2 MGMT cDNA的定點(diǎn)突變38-39
• 3.1.3 MGMT(P140K)亞克隆至PCIneo39-40
• 3.1.4 CMV—MGMT(P140K)連接至pWPT2bF940-41
• 3.2 GFP—LV慢病毒制備與鑒定41-43
• 3.2.1 GFP慢病毒(GFP—LV)的制備41-42
• 3.2.2 GFP慢病毒(GFP—LV)的鑒定42-43
• 3.3 2bF9-MGMT(P140K)-LV制備與FIX的表達(dá)結(jié)果43-45
• 3.3.1 2bF9-MGMT(P140K)慢病毒的制備43
• 3.3.2 2bF9-MGMT(P140K)-LV可成功感染Dami細(xì)胞并表達(dá)FIX43-45
• 3.4 293T細(xì)胞藥物篩選45-46
• 3.5 Dami細(xì)胞藥物篩選條件的進(jìn)一步探索46-47
• 3.6 MGMT(P140K)對(duì)小鼠骨髓造血干細(xì)胞的保護(hù)作用47-48
• 第四章 討論與結(jié)論48-50
• 4.1 討論48-49
• 4.2 結(jié)論49-50
• 參考文獻(xiàn)50-52
• 附錄 實(shí)驗(yàn)溶液的配置52-55
• 綜述55-63
• 參考文獻(xiàn)61-63

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本文編號(hào)：506859