本文關(guān)鍵詞：過表達(dá)關(guān)鍵酶基因?qū)︶劸平湍该{迫耐性的影響，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：利用可再生纖維素原料生產(chǎn)燃料乙醇是國內(nèi)外研究的熱點。乙醇工業(yè)生產(chǎn)過程中釀酒酵母受到多種環(huán)境脅迫條件的影響,包括高濃度乙醇和纖維素水解液中的抑制物等,其中乙酸是纖維素水解液中含量較高的抑制物。脅迫耐受性好的釀酒酵母不僅細(xì)胞活性高保證正常生長和乙醇產(chǎn)量,還可縮短發(fā)酵周期、降低生產(chǎn)成本。因此,選育高脅迫耐受性的釀酒酵母對提高乙醇發(fā)酵效率非常重要。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),添加硫酸鋅可以提高絮凝酵母的環(huán)境脅迫耐受性,且在乙醇連續(xù)發(fā)酵過程中,添加硫酸鋅的酵母Sod1p、Grx5p、Ycr102cp等酶蛋白表達(dá)上調(diào),但這些蛋白在纖維素乙醇生產(chǎn)抑制物耐受性方面的影響還沒有深入研究。本論文研究了SOD1、GRX5及YCR102C三個關(guān)鍵酶基因過表達(dá)對釀酒酵母乙酸耐性及抑制劑存在條件下脅迫耐性的影響。結(jié)果表明,過表達(dá)GRX5、YCR102C的重組菌株在含有5g/L乙酸、5mMH2O2、10%乙醇的平板中及42℃高溫條件下生長優(yōu)于對照菌株,而SOD1過表達(dá)菌株在添加鋅離子后耐性才高于對照菌株,推測鋅添加可提高SOD1酶活性。其次,在5 g/L乙酸脅迫條件下進(jìn)行乙醇發(fā)酵,過表達(dá)SOD1, GRX5及YCR102C的重組菌株發(fā)酵時間均比對照菌株明顯縮短。同時,過表達(dá)GRX5及YCR102C菌株的不同抗氧化酶活性,包括超氧化物歧化酶、過氧化氫酶及谷胱甘肽過氧化物酶等酶活性分別提高50.7%、34.5%、158%以及6.3%、47.4%和16.0%。同時,在該條件下過表達(dá)GRX5及YCR102C都影響了金屬離子的吸收,胞內(nèi)K及Fe含量均得到提高。另外,研究了過表達(dá)GRX5及YCR102C對模擬纖維素水解液發(fā)酵的影響,結(jié)果顯示,重組菌株GRX5-Sc4126的乙醇產(chǎn)率提高了61.4%,達(dá)到0.62 g/L/h,且過表達(dá)菌株比對照菌株具有更快速還原糠醛及5-HMF的能力,糠醛全部消耗時間從對照菌株的84 h縮短到48 h,5-HMF從96 h縮短到60 h：重組菌株YCR102C-Sc4126的乙醇產(chǎn)率提高了36.8%,為0.52 g/L/h,且過表達(dá)菌株降解糠醛及5-HMF的時間均縮短了24小時。對YCR102C過表達(dá)菌株中關(guān)鍵基因的表達(dá)水平與含有空載體的對照菌株進(jìn)行了比較分析,發(fā)現(xiàn)過表達(dá)YCR102C的重組菌株中在乙酸脅迫條件下和無脅迫的對照條件下轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因STB5表達(dá)均上調(diào),表明過表達(dá)該未知功能基因影響了關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)水平。本論文研究結(jié)果表明,過表達(dá)SOD1, GRX5和YCR102C可用于選育脅迫條件下發(fā)酵性能良好的酵母菌株。研究結(jié)果為進(jìn)一步研究脅迫耐性相關(guān)基因的作用機理,選育脅迫耐性良好的工業(yè)乙醇酵母,提高纖維素乙醇發(fā)酵效率提供了參考。
【關(guān)鍵詞】：釀酒酵母 SOD1 GRX5 YCR102C 乙酸 環(huán)境脅迫耐受性
【學(xué)位授予單位】：大連理工大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：TQ926
【目錄】：

• 摘要4-5
• Abstract5-10
• 引言10-11
• 1. 緒論11-26
• 1.1 纖維素乙醇與釀酒酵母11-17
• 1.1.1 纖維素乙醇的生產(chǎn)現(xiàn)狀11-12
• 1.1.2 纖維素原料預(yù)處理12-16
• 1.1.3 纖維素水解液中抑制物組成16-17
• 1.2 釀酒酵母環(huán)境脅迫耐受性17-18
• 1.3 抵抗氧化脅迫的酶學(xué)及非酶學(xué)機制18-23
• 1.3.1 SOD1基因19-20
• 1.3.2 GRX5基因20-21
• 1.3.3 YCR102C基因21
• 1.3.4 乙酸毒性及釀酒酵母反應(yīng)機制21-22
• 1.3.5 目前常見的提高釀酒酵母環(huán)境脅迫耐受性的方法22-23
• 1.4 鋅狀態(tài)與釀酒酵母環(huán)境脅迫耐受性23-24
• 1.5 本研究工作的目的意義和內(nèi)容24-26
• 2 SOD1與脅迫耐受性相關(guān)研究26-53
• 2.1 引言26
• 2.2 實驗材料與儀器26-29
• 2.2.1 菌種及引物26-27
• 2.2.2 培養(yǎng)基及滅菌27
• 2.2.3 主要儀器設(shè)備及相關(guān)試劑27-29
• 2.3 實驗方法29-43
• 2.3.1 自絮凝酵母SPSC01發(fā)酵實驗29-32
• 2.3.2 抗氧化酶活檢測32-35
• 2.3.3 金屬離子測定35
• 2.3.4 RT-qPCR分析實驗35-37
• 2.3.5 構(gòu)建過表達(dá)菌體37-41
• 2.3.6 釀酒酵母過表達(dá)基因SOD1的驗證41-42
• 2.3.7 耐性評價實驗42-43
• 2.3.8 乙酸發(fā)酵實驗43
• 2.4 實驗結(jié)果與討論43-52
• 2.4.1 鋅添加對連續(xù)乙醇發(fā)酵的影響43-44
• 2.4.2 鋅添加對SPSC01連續(xù)發(fā)酵時胞內(nèi)酶活的影響44-45
• 2.4.3 鋅添加對SPSC01連續(xù)發(fā)酵時細(xì)胞脅迫耐受性的影響45-46
• 2.4.4 鋅添加對乙酸脅迫條件下乙醇發(fā)酵的影響46
• 2.4.5 鋅添加對乙酸脅迫下SPSC01谷胱甘肽的影響46-47
• 2.4.6 鋅添加對乙酸脅迫相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平的影響47-48
• 2.4.7 SOD1過表達(dá)菌株構(gòu)建48-49
• 2.4.8 過表達(dá)SOD1對菌株脅迫耐受性的影響49-50
• 2.4.9 過表達(dá)SOD1對菌株乙酸發(fā)酵的影響50-52
• 2.5 本章小結(jié)52-53
• 3 GRX5與脅迫耐受性相關(guān)研究53-73
• 3.1 引言53
• 3.2 實驗材料53-55
• 3.2.1 菌種及引物53-54
• 3.2.2 培養(yǎng)基及滅菌條件54
• 3.2.3 主要儀器及試劑54-55
• 3.3 實驗方法55-58
• 3.3.1 構(gòu)建過表達(dá)菌株55
• 3.3.2 脅迫耐受性分析55-56
• 3.3.3 脅迫條件發(fā)酵性能研究56-57
• 3.3.4 抗氧化酶檢測57
• 3.3.5 胞內(nèi)金屬離子檢測57-58
• 3.4 實驗結(jié)果與討論58-72
• 3.4.1 DNA及轉(zhuǎn)錄水平驗證過表達(dá)菌株58
• 3.4.2 GRX5-Sc4126遺傳穩(wěn)定性實驗58
• 3.4.3 GRX5過表達(dá)對脅迫耐受性的影響58-61
• 3.4.4 過表達(dá)GRX5對乙酸脅迫下發(fā)酵性能的影響61-67
• 3.4.5 過表達(dá)GRX5對高溫脅迫下發(fā)酵性能的影響67-68
• 3.4.6 過表達(dá)GRX5對雙重脅迫下發(fā)酵性能的影響68-69
• 3.4.7 過表達(dá)GRX5對模擬水解液發(fā)酵性能的影響69-71
• 3.4.8 過表達(dá)GRX5對水解液稀釋液發(fā)酵性能的影響71-72
• 3.5 本章小結(jié)72-73
• 4 YCR102C與脅迫耐受性相關(guān)研究73-93
• 4.1 引言73
• 4.2 實驗材料73-75
• 4.2.1 菌種及引物73-74
• 4.2.2 培養(yǎng)基及滅菌條件74-75
• 4.2.3 主要儀器及試劑75
• 4.3 實驗方法75-77
• 4.3.1 構(gòu)建過表達(dá)菌株75
• 4.3.2 脅迫耐受性分析75-76
• 4.3.3 脅迫條件發(fā)酵性能研究76-77
• 4.3.4 抗氧化酶檢測77
• 4.3.5 胞內(nèi)金屬含量檢測77
• 4.4 實驗結(jié)果與討論77-91
• 4.4.1 DNA及轉(zhuǎn)錄水平驗證過表達(dá)菌株77-78
• 4.4.2 YCR102C-Sc4126遺傳穩(wěn)定性實驗78
• 4.4.3 YCR102C過表達(dá)對脅迫耐受性的影響78-80
• 4.4.4 過表達(dá)YCR102C對乙酸脅迫下發(fā)酵性能的影響80-86
• 4.4.5 過表達(dá)YCR102C對高溫脅迫下發(fā)酵性能的影響86-87
• 4.4.6 過表達(dá)YCR102C對雙重脅迫下發(fā)酵性能的影響87-89
• 4.4.7 過表達(dá)YCR102C對模擬水解液發(fā)酵性能的影響89-91
• 4.4.8 過表達(dá)YCR102C對水解液稀釋液發(fā)酵性能的影響91
• 4.5 本章小結(jié)91-93
• 結(jié)論93-94
• 創(chuàng)新點94-95
• 展望95-96
• 參考文獻(xiàn)96-107
• 附錄A 基因序列107-109
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表學(xué)術(shù)論文情況109-110
• 致謝110-112

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