本文關(guān)鍵詞：水稻木聚糖酶抑制蛋白RIXI基因表達(dá)調(diào)控初探，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：木聚糖酶抑制劑在植物的防御過程中發(fā)揮重要作用。木聚糖酶抑制蛋白基因RIXI過表達(dá)水稻的表達(dá)譜分析結(jié)果顯示RIXI過表達(dá)引起12個WRKY基因差異表達(dá)。WRKY家族是植物最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一,響應(yīng)生物和非生物脅迫。RIXI啟動子區(qū)域預(yù)測存在能與WRKY轉(zhuǎn)錄因子特異性結(jié)合的W-box順式作用元件,推測WRKY可能對RIXI表達(dá)有調(diào)控關(guān)系。本研究選取表達(dá)譜中差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子OsWRKY6,OsWRKY46,研究其對RIXI的表達(dá)調(diào)控作用,探究水稻木聚糖酶抑制蛋白基因RIXI的上游調(diào)控模式。主要研究結(jié)論如下：1.稻瘟病侵染后RIXI和OsWRKY相對表達(dá)水平分析：利用熒光定量PCR分析稻瘟病G11侵染野生型水稻日本晴后,OsWRKY46、OsWRKY6和RIXI相對表達(dá)水平。結(jié)果顯示,稻瘟病侵染后RIXI與OsWRKY46的表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)模式,RIXI與OsWRKY6的表達(dá)量呈正相關(guān)模式。初步判斷RIXI與WRKYI都參與了水稻抗病防御反應(yīng),RIXI對水稻的抗病防御起正調(diào)控作用,OsWRKY46可能通過抑制RIXI基因的表達(dá)負(fù)調(diào)控水稻的抗病防御過程,OsWRKY6可能正調(diào)控RIXI基因的表達(dá)。1.OsWRKY與RIXI的互作分析：酵母單雜交實驗結(jié)果顯示,OsWRKY46能結(jié)合RIXI啟動子上的W-box序列,不能結(jié)合突變后的W-box序列,說明OsWRKY46轉(zhuǎn)錄因子通過直接結(jié)合RIXI啟動子上的W-box順式作用元件調(diào)控其表達(dá)。3.OsWRKY與JRIXI啟動子轉(zhuǎn)錄激活作用：利用雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測轉(zhuǎn)錄因子OsWRKY46、Os WRKY6和靶基因RIXI啟動子在煙草葉片中的轉(zhuǎn)錄激活作用,結(jié)果顯示OsWRKY46明顯抑制完整啟動子啟動的熒光素酶活性,但不影響缺失W-box序列啟動的熒光素酶活性,說明OsWRKY46通過結(jié)合RIXI啟動子W-box元件,負(fù)調(diào)控靶基因的表達(dá)；OsWRKY6明顯促進(jìn)完整啟動子啟動的熒光素酶活性,但影響缺失W-box順式作用元件的啟動子序列啟動的熒光素酶活性,說明OsWRKY6蛋白能結(jié)合RIXI啟動子W-box元件,正調(diào)控基因的表達(dá)。4.OsWRKY46過表達(dá)轉(zhuǎn)基因水稻獲得：構(gòu)建Ubi::OsWRKY46過表達(dá)載體,通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化獲得OsWRKY46超表達(dá)水稻。熒光定量PCR結(jié)果顯示OsWRKY46的表達(dá)水平是野生型NIP的3倍多,OsWRKY46過表達(dá)株系中RIXI表達(dá)量與野生型相比明顯下降。進(jìn)一步確定轉(zhuǎn)錄因子與木聚糖酶抑制蛋白之間的調(diào)控作用,OsWRKY46過表達(dá)對RIXI的表達(dá)起抑制作用。同時,過表達(dá)植株的獲得為后續(xù)的研究積累了材料。
【關(guān)鍵詞】：RIXI木聚糖酶抑制蛋白 WRKY轉(zhuǎn)錄因子 表達(dá)調(diào)控
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：Q943.2
【目錄】：

• 致謝10-11
• 摘要11-13
• Abstract13-15
• 縮略詞表15-16
• 第一章 文獻(xiàn)綜述16-30
• 1.1 木聚糖酶抑制劑簡介16-20
• 1.1.1 谷物中木聚糖酶抑制劑研究進(jìn)展16-17
• 1.1.2 谷物中XIP家族木聚糖酶抑制劑概述17-19
• 1.1.2.1 水稻RIXI木聚糖酶抑制劑研究概述18-19
• 1.1.3 木聚糖酶抑制蛋白對生物和非生物脅迫的響應(yīng)19-20
• 1.2 木聚糖酶抑制蛋白基因信號序列和啟動子序列分析20-23
• 1.3 植物轉(zhuǎn)錄因子概述23-28
• 1.3.1 植物WRKY轉(zhuǎn)錄因子概述23-24
• 1.3.2 WRKY轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)特征及分類24-26
• 1.3.2.1 WRKY轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)特征24-25
• 1.3.2.2 WRKY轉(zhuǎn)錄因子分類25-26
• 1.3.2.3 水稻W(wǎng)RKY轉(zhuǎn)錄因子命名26
• 1.3.3 WRKY基因的生物學(xué)功能26-28
• 1.3.3.1 生物脅迫26-27
• 1.3.3.2 非生物脅迫27-28
• 1.4 選題意義28-29
• 1.5 研究內(nèi)容及目標(biāo)29-30
• 第二章 RIXI、WRKY生物信息學(xué)預(yù)測及表達(dá)分析30-44
• 2.1 引言30
• 2.2 材料30-37
• 2.2.1 實驗材料30
• 2.2.2 RIXI啟動子序列分析30-31
• 2.2.3 OsWRKY基因查找及跨膜預(yù)測分析31
• 2.2.4 稻瘟病處理水稻31-32
• 2.2.4.1 病原菌活化及培養(yǎng)31
• 2.2.4.2 水稻的培養(yǎng)及稻瘟病接種31-32
• 2.2.5 qRT-PCR檢測稻瘟病菌侵染后病程相關(guān)蛋白基因表達(dá)水平32-35
• 2.2.5.1 定量引物設(shè)計32
• 2.2.5.2 水稻總RNA提取32-33
• 2.2.5.3 逆轉(zhuǎn)錄和cDNA的獲得33-34
• 2.2.5.4 熒光定量PCR反應(yīng)34-35
• 2.2.6 煙草瞬時表達(dá)35-37
• 2.2.6.1 35S：OsWRKY46-sGFP載體的構(gòu)建35-36
• 2.2.6.2 轉(zhuǎn)化煙草36-37
• 2.3 結(jié)果與分析37-42
• 2.3.1 RIXI啟動子分析37-38
• 2.3.2 WRKY基因及氨基酸序列分析38-39
• 2.3.3 稻瘟病侵染后WRKY相對表達(dá)水平分析39-41
• 2.3.4 OsWRKY46::GFP融合蛋白在煙草表皮細(xì)胞亞細(xì)胞定位分析41-42
• 2.4 討論42-44
• 第三章 RIXI啟動子與WRKY轉(zhuǎn)錄因子互作研究44-61
• 3.1 引言44
• 3.2 材料和方法44-54
• 3.2.1 材料44-45
• 3.2.1.1 植物材料44
• 3.2.1.2 質(zhì)粒與菌株44-45
• 3.2.2 煙草葉片瞬時表達(dá)45-50
• 3.2.2.1 RIXI-promoter::LUC載體的構(gòu)建45-47
• 3.2.2.2 35S::WRKY載體的構(gòu)建47-48
• 3.2.2.3 共轉(zhuǎn)化煙草48-49
• 3.2.2.4 LUC含量測定49-50
• 3.2.3 酵母單雜交50-54
• 3.2.3.1 OsWRKY46：：pGADT7AD載體構(gòu)建50-51
• 3.2.3.2 Prey：：pAbAi載體構(gòu)建51-52
• 3.2.3.3 酵母感受態(tài)制備及轉(zhuǎn)化52-53
• 3.2.3.4 RIXI promoter Prey：：pAbAi酵母驗證53
• 3.2.3.5 OsWRKY46：：pGADT7-AD質(zhì)粒轉(zhuǎn)化53
• 3.2.3.6 酵母第二次驗證53
• 3.2.3.7 涂板驗證53-54
• 3.3 結(jié)果與分析54-60
• 3.3.1 煙草瞬時表達(dá)結(jié)果54-58
• 3.3.1.1 報告子RIXI promoter與pGreenⅡ 0800-LUC載體連接54-56
• 3.3.1.2 效應(yīng)子OsWRKY6,OsWRKY46與pCAMBIA 1300GFP載體連接56-57
• 3.3.1.3 煙草葉片瞬時表達(dá)LUC結(jié)果57-58
• 3.3.2 酵母單雜交結(jié)果58-60
• 3.4 討論60-61
• 第四章 水稻OsWRKY46超表達(dá)株系的獲得及表達(dá)分析61-70
• 4.1 引言61
• 4.2 材料與方法61-65
• 4.2.1 材料61
• 4.2.1.1 轉(zhuǎn)基因背景61
• 4.2.1.2 菌株61
• 4.2.2 超表達(dá)載體的構(gòu)建以及轉(zhuǎn)基因陽性苗的獲得61-64
• 4.2.2.1 Ubi：：OsWRKY46超表達(dá)載體的構(gòu)建61-62
• 4.2.2.2 Ubi：：OsWRKY46超表達(dá)載體的構(gòu)建62-64
• 4.2.2.3 轉(zhuǎn)基因苗陽性植株鑒定64
• 4.2.3 轉(zhuǎn)基因水稻中OsWRKY46的相對表達(dá)水平分析64-65
• 4.2.3.1 定量引物設(shè)計65
• 4.2.3.2 水稻總RNA的提取65
• 4.2.3.3 逆轉(zhuǎn)錄及cDNA的合成65
• 4.2.3.4 轉(zhuǎn)基因植株總RNA的qRT-PCR分析65
• 4.3 結(jié)果與分析65-69
• 4.3.1 獲得目的片段OsWRKY46成熟肽序列65-66
• 4.3.2 OsWRKY46成熟肽序列成功插入pTCK303載體和轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌中66-67
• 4.3.3 成功獲得過表達(dá)轉(zhuǎn)基因水稻67-68
• 4.3.4 篩選得到OsWRKY46過表達(dá)水稻陽性株系68
• 4.3.5 OsWRKY46過表達(dá)水稻中基因表達(dá)水平分析68-69
• 4.4 討論69-70
• 第五章 全文總結(jié)及展望70-73
• 5.1 主要研究結(jié)論70-72
• 5.2 研究展望72-73
• 附錄73-75
• 附錄一 CM培養(yǎng)基配方73-75
• 參考文獻(xiàn)75-82
• 個人簡歷82-83
• 碩士期間發(fā)表論文83

【相似文獻(xiàn)】

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 彭耀耀;水稻木聚糖酶抑制蛋白RIXI基因表達(dá)調(diào)控初探[D];浙江大學(xué);2016年

2 趙麗麗;水稻木聚糖酶抑制蛋白RIXI的功能初探[D];浙江大學(xué);2011年

  本文關(guān)鍵詞：水稻木聚糖酶抑制蛋白RIXI基因表達(dá)調(diào)控初探，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：477522