本文關(guān)鍵詞：β-葡葡糖苷酶基因的克隆及表達(dá)研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：木質(zhì)纖維素是地球上最豐富的可再生資源,可利用纖維素酶將其水解為葡萄糖、寡糖及多種活性苷元。其水解產(chǎn)物可應(yīng)用到多種工業(yè)生產(chǎn)中,如紡織業(yè)、造紙業(yè)、食品業(yè)、動物飼料、燃料、化學(xué)工業(yè)、制藥工業(yè)等領(lǐng)域。p-葡萄糖苷酶能夠水解纖維二糖產(chǎn)生兩分子的葡萄糖,是整個纖維素水解反應(yīng)的限速酶,它決定著纖維素酶整體活力的高低。本論文從提高黑曲霉β-葡萄糖苷酶表達(dá)量與酶活力的角度出發(fā),通過RT-PCR及PCR技術(shù)分別獲得了2583 bp的黑曲霉p-葡萄糖苷酶基因cDNA序列及2934 bp的DNA序列。將其cDNA序列分別克隆到pET28a、pET32a、pPIC9K載體上,分別在大腸桿菌及畢赤酵母中進(jìn)行了異源表達(dá)；將其DNA序列克隆到pPICZaA載體上于畢赤酵母中進(jìn)行了異源表達(dá)。將該p-葡萄糖苷酶基因于不同載體及不同宿主菌中表達(dá)得出：β-葡萄糖苷酶基因在原核中表達(dá)量較高,但其表達(dá)產(chǎn)物沒有p-葡萄糖苷酶水解活性。分析pET28a載體重組子表達(dá)產(chǎn)物可能為包涵體,對其進(jìn)行包涵體變性與復(fù)性處理,仍未檢測到β-葡萄糖苷酶水解活性。pPIC9K重組載體轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115,通過MD及MM平板鑒定其表型為Muts型。該重組畢赤酵母經(jīng)甲醇誘導(dǎo)表達(dá),采用七葉苷及pNPG法檢測其誘導(dǎo)產(chǎn)物p-葡萄糖苷酶活性,結(jié)果表明,該重組子誘導(dǎo)產(chǎn)物具有一定的β-葡萄糖苷酶水解活性,但酶活較低。pPICZaA重組載體轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115,采用PCR技術(shù)鑒定其表型為Mut+型。重組子經(jīng)甲醇誘導(dǎo)表達(dá),粗酶液采用pNPG法檢測其β-葡萄糖苷酶活性,結(jié)果表明,該p-葡萄糖苷酶在30℃,pH 6.0時相對酶活最高,為0.274 U/mL。通過硫酸銨沉淀法及Ni-柱親和層析法對p-葡萄糖苷酶進(jìn)行了分離純化,純化產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE檢測結(jié)果表明,純化之后的雜蛋白較多,需進(jìn)一步探索。
【關(guān)鍵詞】：黑曲霉 β-葡萄糖苷酶 克隆 表達(dá)
【學(xué)位授予單位】：云南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：Q78;Q55
【目錄】：

• 摘要4-5
• Abstract5-11
• 第一章 緒論11-27
• 1 研究背景11-12
• 2 β-葡萄糖苷酶研究進(jìn)展12-13
• 3 β-葡萄糖苷酶分離純化13-14
• 3.1 硫酸銨沉淀法13
• 3.2 親和層析法13
• 3.3 離子交換色譜法13-14
• 3.4 凝膠層析法14
• 3.5 疏水層析14
• 4 β-葡萄糖苷酶性質(zhì)研究14-17
• 4.1 分子量14-15
• 4.2 溫度15
• 4.3 pH15
• 4.4 底物特異性15-16
• 4.5 抑制劑16
• 4.6 激活因子16
• 4.7 動力學(xué)參數(shù)16-17
• 5 β-葡萄糖苷酶結(jié)構(gòu)及功能研究17-18
• 6 β-葡萄糖苷酶催化反應(yīng)機(jī)制18
• 7 β-葡萄糖苷酶活性檢測18-19
• 7.1 pNPG法18
• 7.2 熒光法18-19
• 7.3 DNS法19
• 7.4 京尼平苷法測酶活19
• 8 β-葡萄糖苷酶的應(yīng)用19-22
• 8.1 β-葡萄糖苷酶在纖維素降解中的應(yīng)用19
• 8.2 在食品工業(yè)中的應(yīng)用19-20
• 8.3 水解京尼平苷20
• 8.4 在農(nóng)業(yè)中的應(yīng)用20-21
• 8.5 在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用21
• 8.6 工業(yè)上生產(chǎn)燃料乙醇21
• 8.7 β-葡萄糖苷酶其他應(yīng)用21-22
• 9 β-葡萄糖苷酶基因克隆與表達(dá)研究22-24
• 9.1 β-葡萄糖苷酶在原核系統(tǒng)中的表達(dá)22-23
• 9.2 β-葡萄糖苷酶在畢赤酵母中的表達(dá)23-24
• 10 本課題研究的目的意義24-26
• 11 研究內(nèi)容與技術(shù)路線26-27
• 第二章 材料和方法27-57
• 1 主要儀器設(shè)備27-28
• 2 實驗材料、試劑及培養(yǎng)基28-29
• 2.1 供試菌株與質(zhì)粒28
• 2.2 試劑與酶28-29
• 2.3 培養(yǎng)基與貯備液29
• 3 培養(yǎng)方法29
• 3.1 黑曲霉培養(yǎng)29
• 3.2 大腸桿菌培養(yǎng)29
• 3.3 畢赤酵母GS115培養(yǎng)29
• 4 試驗方法29-57
• 4.1 RNAiso Plus提取黑曲霉總RNA29-30
• 4.2 2×CTAB法提取黑曲霉基因組30-31
• 4.3 β-葡萄糖苷酶基因引物設(shè)計31-32
• 4.4 RT-PCR獲得β-葡萄糖苷酶基因cDNA序列32-33
• 4.5 PCR獲得β-葡萄糖苷酶基因DNA序列33
• 4.6 目的基因轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans1-T133-36
• 4.7 酶切鑒定陽性重組子36-37
• 4.8 目的基因測序驗證與分析37
• 4.9 重組pET28a表達(dá)載體的構(gòu)建37-40
• 4.10 重組pET32a表達(dá)載體的構(gòu)建40-42
• 4.11 重組pPIC9K表達(dá)載體的構(gòu)建42-44
• 4.12 重組pPICZaA表達(dá)載體的構(gòu)建44-49
• 4.13 重組表達(dá)載體pET28a及pET32a轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)49
• 4.14 重組表達(dá)載體pPIC9K及pPICZαA轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS11549-51
• 4.15 GS115重組子的篩選及表型鑒定51-52
• 4.16 重組子BL21(DE3)的誘導(dǎo)表達(dá)及β-葡萄糖苷酶活性檢測52-53
• 4.17 重組畢赤酵母GS115的誘導(dǎo)表達(dá)53
• 4.18 β-葡萄糖苷酶及其活性檢測53-55
• 4.19 β-葡萄糖苷酶的分離純化55-57
• 第三章 結(jié)果與分析57-74
• 1 β-葡萄糖苷酶基因的克隆57-67
• 1.1 黑曲霉總RNA提取與RT-PCR57-58
• 1.2 黑曲霉基因組DNA提取及PCR擴(kuò)增β-葡萄糖苷酶基因58
• 1.3 目的基因轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans1-T158-60
• 1.4 測序驗證與分析60-62
• 1.5 重組表達(dá)載體pET28a及pET32a的構(gòu)建62-65
• 1.6 重組表達(dá)載體pPIC9K及pPICZA的構(gòu)建65-66
• 1.7 畢赤酵母重組子篩選及表型驗證66-67
• 2 重組BL21(DE3)的誘導(dǎo)表達(dá)及β-葡萄糖苷酶檢測67-69
• 2.1 pNPG法檢測β-葡萄糖苷酶活性67-68
• 2.2 七葉苷平板法檢測β-葡萄糖苷酶活性68
• 2.3 SDS-PAGE檢測表達(dá)產(chǎn)物68-69
• 3 重組畢赤酵母誘導(dǎo)表達(dá)及β-葡萄糖苷酶活性檢測69-72
• 3.1 七葉苷法檢測pPIC9K載體重組酵母誘導(dǎo)產(chǎn)物β-葡萄糖苷酶活性69-70
• 3.2 pNPG法檢測pPICZaA載體重組酵母誘導(dǎo)產(chǎn)β-葡萄糖苷酶活性70-72
• 4 β-葡萄糖苷酶的分離純化72-74
• 4.1 硫酸銨沉淀法分離純化β-葡萄糖苷酶72
• 4.2 Ni柱親和層析72-74
• 結(jié)果與討論74-76
• 展望76-77
• 附錄77-83
• (一) 培養(yǎng)基與貯備液77-79
• (二) β-葡萄糖苷酶基因cDNA序列79-80
• (三) β-葡萄糖苷酶基因氨基酸序列預(yù)測80-81
• (四) β-葡萄糖苷酶基因DNA序列81-83
• 參考文獻(xiàn)83-95
• 致謝95

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