本文關鍵詞：β-葡葡糖苷酶基因的克隆及表達研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：木質纖維素是地球上最豐富的可再生資源,可利用纖維素酶將其水解為葡萄糖、寡糖及多種活性苷元。其水解產物可應用到多種工業(yè)生產中,如紡織業(yè)、造紙業(yè)、食品業(yè)、動物飼料、燃料、化學工業(yè)、制藥工業(yè)等領域。p-葡萄糖苷酶能夠水解纖維二糖產生兩分子的葡萄糖,是整個纖維素水解反應的限速酶,它決定著纖維素酶整體活力的高低。本論文從提高黑曲霉β-葡萄糖苷酶表達量與酶活力的角度出發(fā),通過RT-PCR及PCR技術分別獲得了2583 bp的黑曲霉p-葡萄糖苷酶基因cDNA序列及2934 bp的DNA序列。將其cDNA序列分別克隆到pET28a、pET32a、pPIC9K載體上,分別在大腸桿菌及畢赤酵母中進行了異源表達；將其DNA序列克隆到pPICZaA載體上于畢赤酵母中進行了異源表達。將該p-葡萄糖苷酶基因于不同載體及不同宿主菌中表達得出：β-葡萄糖苷酶基因在原核中表達量較高,但其表達產物沒有p-葡萄糖苷酶水解活性。分析pET28a載體重組子表達產物可能為包涵體,對其進行包涵體變性與復性處理,仍未檢測到β-葡萄糖苷酶水解活性。pPIC9K重組載體轉化畢赤酵母GS115,通過MD及MM平板鑒定其表型為Muts型。該重組畢赤酵母經甲醇誘導表達,采用七葉苷及pNPG法檢測其誘導產物p-葡萄糖苷酶活性,結果表明,該重組子誘導產物具有一定的β-葡萄糖苷酶水解活性,但酶活較低。pPICZaA重組載體轉化畢赤酵母GS115,采用PCR技術鑒定其表型為Mut+型。重組子經甲醇誘導表達,粗酶液采用pNPG法檢測其β-葡萄糖苷酶活性,結果表明,該p-葡萄糖苷酶在30℃,pH 6.0時相對酶活最高,為0.274 U/mL。通過硫酸銨沉淀法及Ni-柱親和層析法對p-葡萄糖苷酶進行了分離純化,純化產物經SDS-PAGE檢測結果表明,純化之后的雜蛋白較多,需進一步探索。
【關鍵詞】：黑曲霉 β-葡萄糖苷酶 克隆 表達
【學位授予單位】：云南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：Q78;Q55
【目錄】：

• 摘要4-5
• Abstract5-11
• 第一章 緒論11-27
• 1 研究背景11-12
• 2 β-葡萄糖苷酶研究進展12-13
• 3 β-葡萄糖苷酶分離純化13-14
• 3.1 硫酸銨沉淀法13
• 3.2 親和層析法13
• 3.3 離子交換色譜法13-14
• 3.4 凝膠層析法14
• 3.5 疏水層析14
• 4 β-葡萄糖苷酶性質研究14-17
• 4.1 分子量14-15
• 4.2 溫度15
• 4.3 pH15
• 4.4 底物特異性15-16
• 4.5 抑制劑16
• 4.6 激活因子16
• 4.7 動力學參數16-17
• 5 β-葡萄糖苷酶結構及功能研究17-18
• 6 β-葡萄糖苷酶催化反應機制18
• 7 β-葡萄糖苷酶活性檢測18-19
• 7.1 pNPG法18
• 7.2 熒光法18-19
• 7.3 DNS法19
• 7.4 京尼平苷法測酶活19
• 8 β-葡萄糖苷酶的應用19-22
• 8.1 β-葡萄糖苷酶在纖維素降解中的應用19
• 8.2 在食品工業(yè)中的應用19-20
• 8.3 水解京尼平苷20
• 8.4 在農業(yè)中的應用20-21
• 8.5 在醫(yī)學領域的應用21
• 8.6 工業(yè)上生產燃料乙醇21
• 8.7 β-葡萄糖苷酶其他應用21-22
• 9 β-葡萄糖苷酶基因克隆與表達研究22-24
• 9.1 β-葡萄糖苷酶在原核系統(tǒng)中的表達22-23
• 9.2 β-葡萄糖苷酶在畢赤酵母中的表達23-24
• 10 本課題研究的目的意義24-26
• 11 研究內容與技術路線26-27
• 第二章 材料和方法27-57
• 1 主要儀器設備27-28
• 2 實驗材料、試劑及培養(yǎng)基28-29
• 2.1 供試菌株與質粒28
• 2.2 試劑與酶28-29
• 2.3 培養(yǎng)基與貯備液29
• 3 培養(yǎng)方法29
• 3.1 黑曲霉培養(yǎng)29
• 3.2 大腸桿菌培養(yǎng)29
• 3.3 畢赤酵母GS115培養(yǎng)29
• 4 試驗方法29-57
• 4.1 RNAiso Plus提取黑曲霉總RNA29-30
• 4.2 2×CTAB法提取黑曲霉基因組30-31
• 4.3 β-葡萄糖苷酶基因引物設計31-32
• 4.4 RT-PCR獲得β-葡萄糖苷酶基因cDNA序列32-33
• 4.5 PCR獲得β-葡萄糖苷酶基因DNA序列33
• 4.6 目的基因轉化大腸桿菌Trans1-T133-36
• 4.7 酶切鑒定陽性重組子36-37
• 4.8 目的基因測序驗證與分析37
• 4.9 重組pET28a表達載體的構建37-40
• 4.10 重組pET32a表達載體的構建40-42
• 4.11 重組pPIC9K表達載體的構建42-44
• 4.12 重組pPICZaA表達載體的構建44-49
• 4.13 重組表達載體pET28a及pET32a轉化大腸桿菌BL21(DE3)49
• 4.14 重組表達載體pPIC9K及pPICZαA轉化畢赤酵母GS11549-51
• 4.15 GS115重組子的篩選及表型鑒定51-52
• 4.16 重組子BL21(DE3)的誘導表達及β-葡萄糖苷酶活性檢測52-53
• 4.17 重組畢赤酵母GS115的誘導表達53
• 4.18 β-葡萄糖苷酶及其活性檢測53-55
• 4.19 β-葡萄糖苷酶的分離純化55-57
• 第三章 結果與分析57-74
• 1 β-葡萄糖苷酶基因的克隆57-67
• 1.1 黑曲霉總RNA提取與RT-PCR57-58
• 1.2 黑曲霉基因組DNA提取及PCR擴增β-葡萄糖苷酶基因58
• 1.3 目的基因轉化大腸桿菌Trans1-T158-60
• 1.4 測序驗證與分析60-62
• 1.5 重組表達載體pET28a及pET32a的構建62-65
• 1.6 重組表達載體pPIC9K及pPICZA的構建65-66
• 1.7 畢赤酵母重組子篩選及表型驗證66-67
• 2 重組BL21(DE3)的誘導表達及β-葡萄糖苷酶檢測67-69
• 2.1 pNPG法檢測β-葡萄糖苷酶活性67-68
• 2.2 七葉苷平板法檢測β-葡萄糖苷酶活性68
• 2.3 SDS-PAGE檢測表達產物68-69
• 3 重組畢赤酵母誘導表達及β-葡萄糖苷酶活性檢測69-72
• 3.1 七葉苷法檢測pPIC9K載體重組酵母誘導產物β-葡萄糖苷酶活性69-70
• 3.2 pNPG法檢測pPICZaA載體重組酵母誘導產β-葡萄糖苷酶活性70-72
• 4 β-葡萄糖苷酶的分離純化72-74
• 4.1 硫酸銨沉淀法分離純化β-葡萄糖苷酶72
• 4.2 Ni柱親和層析72-74
• 結果與討論74-76
• 展望76-77
• 附錄77-83
• (一) 培養(yǎng)基與貯備液77-79
• (二) β-葡萄糖苷酶基因cDNA序列79-80
• (三) β-葡萄糖苷酶基因氨基酸序列預測80-81
• (四) β-葡萄糖苷酶基因DNA序列81-83
• 參考文獻83-95
• 致謝95

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1 李遠華;β-葡萄糖苷酶的研究進展(綜述)[J];安徽農業(yè)大學學報;2002年04期

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4 祝長青;李艷紅;周輝;曾獻春;趙惠新;;黑曲霉β-葡萄糖苷酶基因的分離[J];華中師范大學學報(自然科學版);2007年01期

5 閆會平;陳士華;吳興泉;;黑曲霉β-葡萄糖苷酶的研究進展[J];纖維素科學與技術;2007年01期

6 方尚玲;劉源才;張慶華;林英;陳道玉;李世杰;;細菌產β-葡萄糖苷酶發(fā)酵優(yōu)化[J];化學與生物工程;2007年09期

7 潘利華;羅建平;查學強;王貴娟;李想;;海藻酸鈉固定化β-葡萄糖苷酶的制備及其性質研究[J];合肥工業(yè)大學學報(自然科學版);2007年10期

8 趙林果;王平;倪浩;宗雅冬;余世袁;;補料發(fā)酵法制備β-葡萄糖苷酶的研究[J];工業(yè)微生物;2008年06期

9 朱鳳妹;李軍;杜彬;劉長江;;β-葡萄糖苷酶產生菌的選育及其性質研究[J];安徽農業(yè)科學;2008年03期

10 陳紅漫;趙璐;;芽孢桿菌β-葡萄糖苷酶的分離純化及特性研究[J];河北農業(yè)大學學報;2009年03期

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1 孟憲文;宋小紅;陳歷俊;劉長江;;β-葡萄糖苷酶的研究進展[A];中國奶業(yè)協(xié)會年會論文集2009（下冊）[C];2009年

2 劉小杰;何國慶;陳啟和;倪輝;;黑曲霉β-葡萄糖苷酶發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化[A];中國食品科學技術學會第五屆年會暨第四屆東西方食品業(yè)高層論壇論文摘要集[C];2007年

3 易松強;鄭火青;張翠平;魏文挺;胡福良;;蜂蜜中β-葡萄糖苷酶活性測定及來源的研究[A];“蜂之巢”2010年全國蜂產品市場信息交流會暨中國（武漢）蜂業(yè)博覽會論文集[C];2010年

4 張金連;張翠平;鄭火青;易松強;胡福良;;基于β-葡萄糖苷酶活力蜂蜜真?zhèn)舞b別研究[A];2012年全國蜂產品市場信息交流會暨中國（江蘇）蜂業(yè)博覽會論文集[C];2012年

5 張金連;張翠平;鄭火青;易松強;胡福良;;基于β-葡萄糖苷酶活力的蜂蜜真?zhèn)舞b別研究[A];第五屆中國畜牧科技論壇論文集[C];2011年

6 蔡亞楠;郁彩虹;高裙裙;張琦;張耀東;;木犀草素和β-葡萄糖苷酶相互作用的熒光光譜法研究[A];中國化學會第十屆全國發(fā)光分析學術研討會論文集[C];2011年

7 李寧;陳磊;宗敏華;;一種來源于西梅籽的耐受葡萄糖的β-葡萄糖苷酶的分離純化[A];2010年中國農業(yè)工程學會農產品加工及貯藏工程分會學術年會暨華南地區(qū)農產品加工產學研研討會論文摘要集[C];2010年

8 余偉;王宏勛;張曉昱;;酶法轉化槐角異黃酮的研究[A];“環(huán)境與健康”學術研討會論文摘要集[C];2007年

9 劉穎;高晗;范婷婷;;海藻酸鈉包埋交聯(lián)法固定化β-葡萄糖苷酶的研究[A];中國食品科學技術學會第五屆年會暨第四屆東西方食品業(yè)高層論壇論文摘要集[C];2007年

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1 周熒;β-葡萄糖苷酶的固定化及其在異黃酮生物轉化中的應用[D];華中農業(yè)大學;2013年

2 夏偉;嗜熱真菌第3家族β-葡萄糖苷酶的多樣性和分子改造[D];浙江大學;2016年

3 趙林果;β-葡萄糖苷酶的制備與回收利用及其基因的克隆表達[D];南京林業(yè)大學;2007年

4 吳鵬;基因重組酒香酵母菌株高產β-葡萄糖苷酶的高密度液態(tài)發(fā)酵模型及酶學性質研究[D];華中農業(yè)大學;2012年

5 徐榮燕;嗜熱真菌糖苷酶的基因克隆、表達與分子改造[D];山東農業(yè)大學;2010年

6 王玉霞;阿氏絲孢酵母（Trichosporon asahii）β-葡萄糖苷酶及葡萄糖苷類風味物質水解機制的研究[D];江南大學;2012年

7 李倩;β-葡萄糖苷酶基因在調控果實成熟及內源ABA水平中的作用分析[D];中國農業(yè)大學;2015年

8 張益波;新型β-葡萄糖苷酶菌株syzx4篩選、發(fā)酵及酶純化表征和應用[D];吉林大學;2011年

9 朱允華;黃翅大白蟻（Macrotermes barneyi）腸道微生物多樣性分析及β-葡萄糖苷酶基因的克隆與鑒定[D];湖南農業(yè)大學;2012年

10 周慶新;木霉纖維素膨脹因子Swollenin與β-葡萄糖苷酶的功能研究[D];山東大學;2011年

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1 劉曉靜;白蟻腸道元基因組來源β-葡萄糖苷酶bgl2、bgl15和bgl17的酶學性質研究[D];江蘇科技大學;2015年

2 楊世玲;酒酒球菌β-葡萄糖苷酶活性及其對葡萄酒香氣的影響研究[D];西北農林科技大學;2015年

3 陳靜;米曲霉gif-10 β-葡萄糖苷酶在畢赤酵母中的表達及性質研究[D];四川農業(yè)大學;2013年

4 徐星;黑曲霉產β-葡萄糖苷酶發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化及其對薯蕷皂苷的水解作用[D];天津科技大學;2014年

5 高天龍;β-葡萄糖苷酶的理性改造[D];山東大學;2014年

6 楊娟;鮑魚臟器β-葡萄糖苷酶的提取、活性分析及性質研究[D];福建農林大學;2013年

7 胡丹;橡膠籽中β-葡萄糖苷酶的熱穩(wěn)定性研究[D];海南大學;2016年

8 夏玉林;β-葡萄糖苷酶基因的篩選及性質分析[D];廣東藥科大學;2016年

9 沙莎;β-葡萄糖苷酶的生產菌株選育、固定化及分離純化的研究[D];華中農業(yè)大學;2013年

10 華駿;β-葡萄糖苷酶高產菌株選育及其酶學性質研究[D];安徽工程大學;2016年

  本文關鍵詞：β-葡葡糖苷酶基因的克隆及表達研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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