本文關(guān)鍵詞：人參發(fā)根體細胞胚胎發(fā)生初期相關(guān)基因的表達分析，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：人參為五加科多年生草本植物,是名貴的中藥材。研究表明,其主要次生代謝產(chǎn)物人參皂苷,在調(diào)節(jié)人的中樞神經(jīng)系統(tǒng)、提高免疫力、抗疲勞、抗氧化、抗腫瘤、降血糖等方面有著很好的功效,因此被廣泛用于藥品、保健品、化妝品等各類產(chǎn)品中,具有可觀的經(jīng)濟價值和廣闊的應(yīng)用前景。但是,由于野生人參資源匱乏、栽培周期長、人參品質(zhì)易受環(huán)境影響等,導致高品質(zhì)人參的市場供應(yīng)量較少、價格昂貴。本研究主要是通過分析人參發(fā)根體細胞胚胎發(fā)生初期相關(guān)基因的表達情況,為進一步建立高效穩(wěn)定的人參發(fā)根體細胞胚胎發(fā)生體系打下堅實的基礎(chǔ)。人參發(fā)根是由發(fā)根農(nóng)桿菌侵染人參根部誘導所產(chǎn)生的組織,以其為外植體進行人參體細胞胚胎發(fā)生具有諸多優(yōu)點,這一技術(shù)已成為人參快速繁殖和種質(zhì)創(chuàng)新的重要手段。在本研究,以人參發(fā)根為外植體進行愈傷組織及胚性愈傷組織的誘導及繼代培養(yǎng),選定與植物體細胞胚發(fā)生相關(guān)的LBD家族、MAPK家族、WRKY家族轉(zhuǎn)錄因子中的LBD29、MAPK4、MAPK6、WRKY3、WRKY6、WRKY27基因,利用半定量PCR及熒光實時定量PCR技術(shù)對以上基因在人參發(fā)根體細胞胚胎發(fā)生初期階段的表達情況進行分析。本研究內(nèi)容如下:1.以本實驗室培養(yǎng)的人參發(fā)根為材料,進行發(fā)根繼代培養(yǎng)、愈傷組織及胚性愈傷組織的誘導和繼代培養(yǎng),得到實驗所需的四種不同發(fā)育階段的組織材料。2.根據(jù)植物體細胞胚胎發(fā)生的文獻報道,查閱GenBank中其他植物相關(guān)基因的核酸序列,利用同源比對的方法設(shè)計引物,成功克隆人參5S rRNA基因及LBD29、MAPK4、MAPK6、WRKY3、WRKY6、WRKY27基因核心片段并進行測序。3.通過半定量PCR研究6個目的基因在人參發(fā)根體細胞胚胎發(fā)生初期四種不同發(fā)育階段的表達情況。選取人參5S rRNA基因為內(nèi)參基因,對LBD29、MAPK4、MAPK6、WRKY3、WRKY6和WRKY27基因表達情況進行半定量分析。半定量PCR結(jié)果顯示,這6個基因在人參發(fā)根體細胞胚胎發(fā)生初期四種不同發(fā)育階段的表達水平均存在明顯差異,因此推測這6個基因與人參發(fā)根體細胞胚胎發(fā)生初期階段相關(guān)。4.分別對6個目的基因的表達情況進行熒光實時定量PCR檢測,熒光實時定量PCR結(jié)果與半定量PCR結(jié)果基本一致,進一步證實人參LBD29、MAPK4、MAPK6、WRKY3、WRKY6、WRKY27基因與人參發(fā)根體細胞胚胎發(fā)生初期階段相關(guān)。5.成功克隆得到人參WRKY6基因CDS序列。測序結(jié)果顯示,人參WRKY6基因長度為1041bp,其與西洋參PqWRKY6核酸序列相似度為99.61%,氨基酸序列相似度為97.63%。生物信息學分析表明,該核酸片段為人參WRKY6基因CDS序列,命名為PgWRKY6并提交GenBank(檢索號:KT277547.1)。
【關(guān)鍵詞】：人參發(fā)根 胚胎發(fā)生 半定量PCR 熒光實時定量PCR
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：Q943.2;S567.51
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-10
• 第1章 緒論10-22
• 1.1 研究的目的和意義10-11
• 1.2 人參體細胞胚胎發(fā)生11-12
• 1.2.1 人參組織培養(yǎng)的研究進展11
• 1.2.2 人參發(fā)根體胚發(fā)生的研究進展11-12
• 1.3 LBD基因家族12-13
• 1.3.1 LBD基因的結(jié)構(gòu)及功能12
• 1.3.2 LBD基因與植物的生長發(fā)育12-13
• 1.4 MAPK基因家族13-15
• 1.4.1 MAPK參與植物生物及非生物脅迫響應(yīng)14-15
• 1.4.2 MAPK參與植物激素的信號轉(zhuǎn)導15
• 1.4.3 MAPK與植物生長發(fā)育相關(guān)15
• 1.5 WRKY轉(zhuǎn)錄因子15-18
• 1.5.1 WRKY參與植物生物和非生物脅迫響應(yīng)16-17
• 1.5.2 WRKY參與植物激素的信號轉(zhuǎn)導17
• 1.5.3 WRKY與植物生長發(fā)育相關(guān)17-18
• 1.6 植物生長發(fā)育與 2,4-D18-19
• 1.7 半定量PCR19
• 1.8 熒光實時定量PCR19-22
• 第2章 人參愈傷組織及胚性愈傷的誘導和增殖22-30
• 2.1 引言22
• 2.2 實驗材料及儀器22-24
• 2.2.1 實驗材料22-23
• 2.2.2 實驗儀器23-24
• 2.3 實驗方法24-26
• 2.3.1 人參發(fā)根繼代培養(yǎng)24
• 2.3.2 2,4-D濃度與人參組織培養(yǎng)24-25
• 2.3.3 人參發(fā)根愈傷組織的誘導及增殖25
• 2.3.4 人參發(fā)根胚性愈傷組織的誘導及增殖25-26
• 2.4 結(jié)果與分析26-27
• 2.4.1 2,4-D濃度與人參組織培養(yǎng)26-27
• 2.4.2 人參組織培養(yǎng)27
• 2.5 討論27-28
• 2.5.1 培養(yǎng)基的選擇27-28
• 2.5.2 外源激素的添加28
• 2.6 小結(jié)28-30
• 第3章 人參體細胞胚胎發(fā)生初期相關(guān)基因的克隆30-48
• 3.1 引言30
• 3.2 實驗材料及儀器30-32
• 3.2.1 實驗材料30-31
• 3.2.2 實驗儀器31-32
• 3.3 實驗方法32-36
• 3.3.1 總RNA提取及c DNA合成32-33
• 3.3.2 引物設(shè)計33-34
• 3.3.3 基因的克隆與純化34-36
• 3.3.4 基因測序及序列對比36
• 3.4 結(jié)果與分析36-46
• 3.4.1 總RNA提取及c DNA合成36-37
• 3.4.2 基因的克隆、純化及測序37-46
• 3.5 討論46-47
• 3.5.1 引物設(shè)計46
• 3.5.2 PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化46-47
• 3.6 小結(jié)47-48
• 第4章 半定量PCR及熒光實時定量PCR48-62
• 4.1 引言48
• 4.2 實驗材料及儀器48-49
• 4.2.1 實驗材料48-49
• 4.2.2 實驗儀器49
• 4.3 實驗方法49-50
• 4.3.1 半定量PCR49
• 4.3.2 熒光實時定量PCR49-50
• 4.4 結(jié)果與分析50-59
• 4.4.1 5S rRNA內(nèi)參基因50-51
• 4.4.2 LBD29基因51-52
• 4.4.3 MAPK4基因52-53
• 4.4.4 MAPK6基因53-55
• 4.4.5 WRKY3基因55-56
• 4.4.6 WRKY27基因56-57
• 4.4.7 WRKY6基因57-59
• 4.5 討論59-60
• 4.5.1 RNA提取質(zhì)量59-60
• 4.5.2 內(nèi)參基因的選擇60
• 4.5.3 反應(yīng)循環(huán)數(shù)60
• 4.6 小結(jié)60-62
• 第5章 結(jié)論與展望62-64
• 5.1 結(jié)論62-63
• 5.2 展望63-64
• 參考文獻64-70
• 在校期間科研成果70-71
• 致謝71

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