本文關(guān)鍵詞：耐鹽基因SeNHX1在煙草中的表達(dá)研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：SeNHX1基因是從鹽生植物鹽角草中(Saliconia europaea L.)克隆得到的液泡型Na+/H+逆向運(yùn)輸?shù)鞍谆?其表達(dá)的Na+/H+逆向運(yùn)輸?shù)鞍锥ㄎ辉谝号菽ど�。液泡型Na+/H+逆向運(yùn)輸?shù)鞍卓蓪⒓?xì)胞質(zhì)中的Na+轉(zhuǎn)運(yùn)至液泡中,其在維持細(xì)胞質(zhì)內(nèi)離子平衡,調(diào)節(jié)細(xì)胞質(zhì)酸堿度和維持細(xì)胞滲透壓等方面發(fā)揮著重要作用。在前期研究工作中,利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法對(duì)煙草進(jìn)行耐鹽基因SeNHX1轉(zhuǎn)化,并獲得了煙草轉(zhuǎn)化植株。為了探討耐鹽基因SeNHX1在煙草中的表達(dá)規(guī)律,及其對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草耐鹽性的影響,本論文研究課題以轉(zhuǎn)SeNHX1基因煙草轉(zhuǎn)化植株為材料,對(duì)其進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定,利用RT-PCR、實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)SeNHX1基因在轉(zhuǎn)基因煙草中的表達(dá)及表達(dá)量進(jìn)行測(cè)定,并對(duì)轉(zhuǎn)SeNHX1煙草在鹽脅迫下的生理生化特征進(jìn)行檢測(cè)和分析。主要研究結(jié)果如下:(1)對(duì)轉(zhuǎn)SeNHX1基因煙草T0代轉(zhuǎn)化植株進(jìn)行PCR檢測(cè),結(jié)果顯示SeNHX1基因成功轉(zhuǎn)入煙草中,初步確定6株轉(zhuǎn)SeNHX1基因煙草植株,分別為S1、S2、S3、S4、S5、S6;分別對(duì)以上轉(zhuǎn)基因煙草植株T1代進(jìn)行PCR檢測(cè),結(jié)果初步表明SeNHX1基因遺傳到轉(zhuǎn)基因煙草T1代中。(2)分別提取轉(zhuǎn)SeNHX1基因煙草和非轉(zhuǎn)基因煙草的RNA,反轉(zhuǎn)錄生成cDNA進(jìn)行RT-PCR,凝膠電泳出現(xiàn)陽性條帶,表明轉(zhuǎn)基因煙草中SeNHX1基因在轉(zhuǎn)錄水平上表達(dá),并進(jìn)一步確定其為轉(zhuǎn)基因植株。(3)利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)Se NHX1基因在轉(zhuǎn)基因煙草中的表達(dá)量進(jìn)行測(cè)定,SeNHX1基因在非轉(zhuǎn)基因煙草和轉(zhuǎn)基因煙草S1、S2、S3、S4、S5、S6中的表達(dá)量分別為:0%、20%、26.7%、14.29%、25%、12.5%、23.1%。(4)以NaCl為鹽脅迫因子,脅迫濃度分別為0 mmol/L、100 mmol/L、200 mmol/L;檢測(cè)非轉(zhuǎn)基因和轉(zhuǎn)SeNHX1基因煙草在不同鹽脅迫濃度下的抗氧化酶活性、MDA和葉綠素含量的變化,結(jié)果如下:1)非轉(zhuǎn)基因煙草和轉(zhuǎn)SeNHX1基因煙草的SOD、APX、CAT、POD活性隨鹽濃度的升高而升高,轉(zhuǎn)SeNHX1基因煙草抗氧化酶活性均高于同NaCl脅迫濃度的非轉(zhuǎn)基因煙草。2)在無鹽脅迫的處理?xiàng)l件下,轉(zhuǎn)SeNHX1基因煙草和非轉(zhuǎn)基因煙草的MDA含量差異不大,在鹽脅迫下,所有煙草MDA含量隨著NaCl濃度的升高而升高,所有轉(zhuǎn)SeNHX1基因煙草植株的MDA含量均低于非轉(zhuǎn)基因煙草。3)在鹽脅迫下,轉(zhuǎn)SeNHX1基因煙草和非轉(zhuǎn)基因煙草的葉綠素含量均下降,并且與NaCl濃度呈負(fù)相關(guān);在同NaCl脅迫濃度處理?xiàng)l件下,非轉(zhuǎn)基因煙草葉綠素含量低于轉(zhuǎn)SeNHX1煙草,并且隨著NaCl濃度升高,下降明顯。(5)將轉(zhuǎn)SeNHX1基因煙草的T0代種子和非轉(zhuǎn)基因煙草種子用次氯酸鈉消毒后播種于含0 mmol/L、50 mmol/L、100 mmol/L、150 mmol/L、200 mmol/L NaCl的1/2 MS培養(yǎng)基上,2周后統(tǒng)計(jì)發(fā)芽率。結(jié)果如下:1)在0 mmol/L NaCl的處理?xiàng)l件下,非轉(zhuǎn)基因煙草和轉(zhuǎn)SeNHX1基因煙草種子的發(fā)芽率都接近100%;2)當(dāng)NaCl濃度為50mmol/L、100 mmol/L時(shí),所有煙草種子發(fā)芽率呈下降趨勢(shì),但非轉(zhuǎn)基因相對(duì)轉(zhuǎn)SeNHX1基因煙草下降幅度稍大;3)當(dāng)NaCl濃度為150 mmol/L時(shí),所有煙草種子發(fā)芽率大幅度下降,非轉(zhuǎn)基因煙草種子下降顯著;4)當(dāng)NaCl濃度為200 mmol/L時(shí),所有煙草種子發(fā)芽率降至最低,非轉(zhuǎn)基因發(fā)芽率只有8%,轉(zhuǎn)基因煙草發(fā)芽率在25%左右,其中S3轉(zhuǎn)SeNHX1基因煙草植株發(fā)芽率最高。
【關(guān)鍵詞】：轉(zhuǎn)SeNHX1基因煙草 PCR RT-PCR 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 抗氧化物酶活性 MDA含量 葉綠素含量 種子發(fā)芽率
【學(xué)位授予單位】：河南科技學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S572
【目錄】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-11
• 第一章 文獻(xiàn)綜述11-29
• 1.1 鹽脅迫對(duì)植物造成的傷害12-15
• 1.1.1 滲透脅迫12
• 1.1.2 離子毒害12-13
• 1.1.3 次生脅迫效應(yīng)13
• 1.1.4 破壞正常新陳代謝作用13-15
• 1.2 植物的耐鹽機(jī)制15-21
• 1.2.1 形態(tài)耐鹽15-16
• 1.2.2 滲透調(diào)節(jié)16-18
• 1.2.3 活性氧清除機(jī)制18-19
• 1.2.4 離子平衡19-21
• 1.3 Na~+/H~+ 逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白研究進(jìn)展21-27
• 1.3.1 Na~+/H~+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的發(fā)現(xiàn)及細(xì)胞中定位21-22
• 1.3.2 Na~+/H~+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的結(jié)構(gòu)22-24
• 1.3.3 Na~+/H~+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白功能及作用機(jī)制24-27
• 1.3.4 Na~+/H~+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因工程研究27
• 1.4 研究?jī)?nèi)容及目的27-29
• 第二章 耐鹽基因SeNHX1在轉(zhuǎn)基因煙草中的初步表達(dá)分析29-47
• 2.1 材料與方法29-31
• 2.1.1 植物材料29
• 2.1.2 大腸桿菌工程菌質(zhì)粒29-30
• 2.1.3 主要試劑30
• 2.1.4 主要儀器設(shè)備30-31
• 2.2 方法31-38
• 2.2.1 植物材料的準(zhǔn)備31
• 2.2.2 轉(zhuǎn)SeNHX1基因煙草轉(zhuǎn)化植株P(guān)CR檢測(cè)31-33
• 2.2.3 轉(zhuǎn)SeNHX1基因煙草的RNA提取33-35
• 2.2.4 煙草RNA濃度、純度的檢測(cè)35-36
• 2.2.5 煙草總RNA反轉(zhuǎn)錄36
• 2.2.6 轉(zhuǎn)SeNHX1基因煙草RT-PCR檢測(cè)36-37
• 2.2.7 轉(zhuǎn)SeNHX1基因煙草的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)37-38
• 2.2.8 轉(zhuǎn)SeNHX1基因煙草T_1代PCR鑒定38
• 2.3 結(jié)果與分析38-43
• 2.3.1 轉(zhuǎn)SeNHX 1 基因煙草轉(zhuǎn)化植株P(guān)CR電泳結(jié)果與分析38-39
• 2.3.2 煙草RNA提取質(zhì)量檢測(cè)結(jié)果39-40
• 2.3.3 轉(zhuǎn)SeNHX 1 基因煙草RT- PCR電泳結(jié)果與分析40-41
• 2.3.4 轉(zhuǎn)SeNHX1煙草中SeNHX1基因的表達(dá)結(jié)果與分析41-42
• 2.3.5 轉(zhuǎn)SeNHX1基因煙草T_1代PCR結(jié)果與分析42-43
• 2.4 討論43-47
• 2.4.1 不同植物NHX1基因生物的同源性分析43-44
• 2.4.2 SeNHX1基因在轉(zhuǎn)基因煙草的表達(dá)量44
• 2.4.3 植物葉片總RNA的提取優(yōu)化44-45
• 2.4.4 關(guān)于RT-PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化45
• 2.4.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR的問題及優(yōu)化方案45-47
• 第三章 轉(zhuǎn)SeNHX1基因煙草耐鹽性分析47-63
• 3.1 材料47
• 3.1.1 植物材料47
• 3.1.2 主要試劑47
• 3.1.3 主要儀器設(shè)備47
• 3.2 方法47-53
• 3.2.1 轉(zhuǎn)SeNHX1基因煙草T_0代耐鹽性脅迫處理47-48
• 3.2.2 轉(zhuǎn)基因煙草SOD活性測(cè)定48-49
• 3.2.3 轉(zhuǎn)基因煙草APX活性測(cè)定49-50
• 3.2.4 轉(zhuǎn)基因煙草CAT活性測(cè)定50
• 3.2.5 轉(zhuǎn)基因煙草POD活性測(cè)定50-51
• 3.2.6 轉(zhuǎn)基因煙草MDA含量測(cè)定51-52
• 3.2.7 轉(zhuǎn)基因煙草葉綠素含量測(cè)定52
• 3.2.8 轉(zhuǎn)SeNHX1基因煙草種子在不同NaCl濃度下的發(fā)芽率檢測(cè)52-53
• 3.3 結(jié)果與分析53-59
• 3.3.1 轉(zhuǎn)基因煙草SOD活性測(cè)定結(jié)果與分析53-54
• 3.3.2 轉(zhuǎn)基因煙草APX活性測(cè)定結(jié)果與分析54
• 3.3.3 轉(zhuǎn)基因煙草CAT活性測(cè)定結(jié)果與分析54-55
• 3.3.4 轉(zhuǎn)基因煙草POD活性測(cè)定結(jié)果與分析55-56
• 3.3.5 轉(zhuǎn)基因煙草MDA含量測(cè)定結(jié)果與分析56-57
• 3.3.6 轉(zhuǎn)基因煙草葉綠素含量測(cè)定結(jié)果與分析57-59
• 3.3.7 轉(zhuǎn)基因煙草種子在不同NaCl濃度下的發(fā)芽率統(tǒng)計(jì)結(jié)果與分析59
• 3.4 討論59-63
• 3.4.1 Na~+/H~+ 逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在鹽脅迫下的作用機(jī)理59-60
• 3.4.2 SeNHX1基因在煙草中的表達(dá)與鹽脅迫下生理生化變化的關(guān)系60-63
• 第四章 全文討論與結(jié)論63-67
• 4.1 轉(zhuǎn)SeNHX1基因煙草轉(zhuǎn)化植株分子生物學(xué)鑒定63
• 4.2 SeNHX1在轉(zhuǎn)基因煙草中的表達(dá)63
• 4.3 轉(zhuǎn)SeNHX1基因煙草T_0代在鹽脅迫下生理生化變化63-65
• 4.4 耐鹽基因SeNHX1對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草T_0代種子在鹽脅迫下發(fā)芽率的影響65
• 4.5 SeNHX1基因表達(dá)與轉(zhuǎn)基因煙草耐鹽性關(guān)系65-66
• 4.6 下一步研究工作的設(shè)想66-67
• 參考文獻(xiàn)67-75
• 致謝75

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本文編號(hào)：414944