OsRhoGAP2是通過酵母雙雜交從水稻幼穗組織分離的一種Rho GTP酶激活蛋白質(zhì)編碼基因,其功能尚不明確。為鑒定該基因的功能,本研究采用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建了OsRhoGAP2基因單靶標(biāo)敲除載體,并轉(zhuǎn)化日本晴水稻。對轉(zhuǎn)基因水稻的篩選以及編輯靶點(diǎn)擴(kuò)增和測序結(jié)果表明,在T₀代獲得3種雜合突變體,在T₁代獲得2種純合突變體,命名為株系1和株系16。2個純合敲除株系在OsRhoGAP2編輯靶點(diǎn)分別缺失2個和1個堿基,均導(dǎo)致該基因的移碼突變并最終造成無義突變。序列分析顯示,突變體中預(yù)期生成的OsRhoGAP2截短蛋白質(zhì)喪失了保守的RhoGAP結(jié)構(gòu)域及CRIB基序。抽穗期水稻的葉片掃描電鏡觀察結(jié)果顯示,株系1的葉片表皮毛大量缺失;對抽穗期水稻的劍葉進(jìn)行光合指標(biāo)測量,發(fā)現(xiàn)突變體與野生型在凈光合速率與氣孔導(dǎo)度上存在顯著差異。其中,株系1和株系16的凈光合速率分別上升17.79%和7.70%,氣孔導(dǎo)度分別上升113.10%和64.50%,提示OsRhoGAP2基因的功能可能涉及這些生物學(xué)過程。

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【文章目錄】：
1 材料與方法
    1.1 材料
    1.2 OsRhoGAP2蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建
    1.3 編輯靶點(diǎn)設(shè)計(jì)及gRNA合成
    1.4 敲除載體構(gòu)建
    1.5 水稻的遺傳轉(zhuǎn)化及篩選
    1.6 OsRhoGAP2編輯水稻抽穗期與成熟期的表型鑒定
    1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
2 結(jié)果
    2.1 OsRhoGAP2蛋白系統(tǒng)進(jìn)化分析
    2.2 OsRhoGAP2基因敲除靶位點(diǎn)的特異性分析和表達(dá)載體構(gòu)建
    2.3 T0代OsRhoGAP2敲除水稻的篩選
    2.4 OsRhoGAP2敲除水稻純合株系鑒定
    2.5 Cas9-GAP2水稻凈光合速率與氣孔導(dǎo)度顯著上升
    2.6 Cas9-GAP2水稻葉片表面的超微結(jié)構(gòu)觀察
    2.7 Cas9-GAP2水稻農(nóng)藝學(xué)性狀統(tǒng)計(jì)分析
3 討論



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