為揭示羽衣甘藍(lán)二氫黃酮醇4-還原酶(DFR)基因調(diào)控花青素合成的功能,該研究對(duì)不同葉色羽衣甘藍(lán)的葉片花青素含量進(jìn)行測(cè)定,根據(jù)結(jié)球甘藍(lán)DFR序列信息,利用RT-PCR技術(shù)克隆羽衣甘藍(lán)BoDFR基因并進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量表達(dá)分析。結(jié)果表明:BoDFR的cDNA全長(zhǎng)為1 158 bp,編碼385個(gè)氨基酸,其蛋白相對(duì)分子質(zhì)量為42 925.06 Da,預(yù)測(cè)亞細(xì)胞定位為細(xì)胞質(zhì);蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)分析表明α-螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲為DFR蛋白的主要二級(jí)結(jié)構(gòu)元件。序列比對(duì)顯示DFR蛋白具有NADPH結(jié)合位點(diǎn)和底物結(jié)合位點(diǎn),屬于NADB-Rossmann超基因家族。系統(tǒng)進(jìn)化分析表明,BoDFR與結(jié)球甘藍(lán)(Brassica oleracea var.capitata)DFR親緣關(guān)系最近�；ㄇ嗨睾繙y(cè)定顯示,紫葉羽衣甘藍(lán)葉片中花青素含量最高,粉葉羽衣甘藍(lán)含量較高,而白葉羽衣甘藍(lán)葉片中檢測(cè)不到花青素。實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析表明,BoDFR基因表達(dá)量與花青素含量高低一致,其中紫葉羽衣甘藍(lán)葉片中BoDFR基因的表達(dá)量最高,而白葉羽衣甘藍(lán)心葉中僅微量表達(dá)。

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【部分圖文】：

圖1 不同葉色羽衣甘藍(lán)試材

花青素提取參考李果等[11]的方法。取0.3g樣品用1%鹽酸甲醇4℃提取24h,12000r·min-1離心15min,取上清液定容至10mL。將樣品分別用25mmol·L-1氯化鉀溶液(pH1.0)和400mmol·L-1醋酸鈉溶液(pH4.5....

圖2 不同試材心葉花青素含量

以羽衣甘藍(lán)葉片cDNA為模板,擴(kuò)增出一段約1000bp的片段(圖3)。將該片段連接pEASY載體,轉(zhuǎn)化大腸桿菌后,經(jīng)測(cè)序獲得該片段完整序列,命名為BoDFR。序列分析結(jié)果顯示,紫葉羽衣甘藍(lán)BoDFR基因編碼區(qū)全長(zhǎng)1158bp(圖3),編碼385個(gè)氨基酸,其蛋白....

圖3 BoDFR擴(kuò)增結(jié)果

通過(guò)Blast對(duì)克隆得到的BoDFR基因編碼的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)分析,結(jié)果表明,羽衣甘藍(lán)DFR蛋白與結(jié)球甘藍(lán)的相似性最高,達(dá)到99.48%;與其他十字花科植物,如大白菜、甘藍(lán)型油菜、芥菜、蘿卜、擬南芥、醉蝶花相似性在72.42%～98.44%;而與其他5種非同科作物的相似性為69....

圖4 BoDFR 蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

為了研究DFR基因在不同葉色羽衣甘藍(lán)中的表達(dá)情況,提取紫色、粉色、白色3個(gè)不同顏色心葉品系葉片的總RNA,反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA,以之為模板,利用熒光定量PCR檢測(cè)BoDFR在不同葉色羽衣甘藍(lán)心葉的表達(dá)模式(圖7)。結(jié)果表明,BoDFR在3個(gè)試材心葉中均有表達(dá),在紫色羽衣甘藍(lán)心....

本文編號(hào)：4029302