目的:構(gòu)建靶向PD-L1基因的CRISPR/Cas9基因敲除質(zhì)粒。方法:根據(jù)CRISPR/Cas9靶點(diǎn)設(shè)計原則,設(shè)計并合成靶向PD-L1基因的5對sgRNA序列。為了進(jìn)一步降低克隆背景和提高構(gòu)建陽性率,在受體載體中引入毒性蛋白系統(tǒng)(Ccd)。構(gòu)建p X459-Ccd B重組載體,將p X459-Ccd B載體進(jìn)行BbsⅠ酶切,將sgRNA插入到p X459-Ccd B骨架載體中,轉(zhuǎn)化到不含Ccd A基因的宿主菌Stbl3中。酶切不完全引起的背景載體將因毒性蛋白的作用殺死宿主菌。轉(zhuǎn)化后挑取陽性克隆,進(jìn)行PCR和測序驗(yàn)證。結(jié)果與結(jié)論:經(jīng)PCR和測序驗(yàn)證,重組質(zhì)粒p X459-PD-L1-sgRNA構(gòu)建成功,為下一步體內(nèi)外敲除PD-L1基因和深入研究其在腫瘤免疫逃逸中的功能奠定了基礎(chǔ)。

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【文章目錄】：
1 材料與方法
    1.1主要試劑和菌株
    1.2靶向PD-L1基因的gRNA的設(shè)計和選擇
    1.3引物合成
    1. 4 質(zhì)粒p X459-Ccd B的構(gòu)建
        1.4.1構(gòu)建過程
        1.4.2 Ccd B基因的擴(kuò)增
        1.4.3目的片段與載體片段的連接
        1.4.4 p X459-Ccd B的驗(yàn)證
    1.5載體pX 459-PD-L1-sgRNA的構(gòu)建
2 結(jié)果
    2.1 pX 459-CcdB的酶切鑒定
    2.2 pX 459-PD-L1-sgRNA的PCR鑒定
    2.3 pX 459-PD-L1-sgRNA的測序
3 討論



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