一、β1,4 N-乙酰半乳糖胺轉(zhuǎn)移酶(β1,4 N-acetylgalactosaminyl transferase,β4Gal NT2)基因敲除豬的制備豬β4Gal NT2及其產(chǎn)物是引起異種移植排斥反應(yīng)的重要非Gal抗原之一。為了進(jìn)一步降低異種移植排斥反應(yīng),本研究在α-1,3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶基因(α-1,3-galactosyltransferase,GGTA1)敲除的巴馬小型豬基礎(chǔ)上,利用規(guī)律成簇間隔短回文重復(fù)/Cas9(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/Cas9,CRISPR/Cas9)技術(shù)制備β4Gal NT2基因敲除豬。設(shè)計(jì)靶向豬β4Gal NT2基因的單鏈導(dǎo)向RNA(Single guide RNA,sg RNA),構(gòu)建sg RNA表達(dá)載體,將其電轉(zhuǎn)染GGTA1基因敲除豬耳成纖維細(xì)胞,進(jìn)行單細(xì)胞培養(yǎng)。采用PCR、TA克隆及測序的方法鑒定單細(xì)胞克隆的突變類型。選擇β4Gal NT2基因突變的單細(xì)胞克隆為核供體,通過體細(xì)胞核移植技術(shù)制備β4Gal NT2基因敲除豬。利用上述鑒定單細(xì)胞克隆突變類型的...

【文章頁數(shù)】：64 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
SUMMARY
英文縮略
第一部分 文獻(xiàn)綜述
    1 豬 Β4GALNT2與異種器官移植
        1.1 異種器官移植
        1.2 豬 β4GalNT2基因
    2 ZBED6與肌肉生長
        2.1 ZBED6的發(fā)現(xiàn)
        2.2 ZBED6的研究進(jìn)展
    3 CRISPR/CAS9的發(fā)現(xiàn)及發(fā)展
    4 本研究的目的和意義
第二部分 CRISPR/CAS9介導(dǎo)的 Β4GALNT2基因敲除豬制備
    1 實(shí)驗(yàn)材料
        1.1 動物性材料
        1.2 主要試劑及實(shí)驗(yàn)耗材
        1.3 主要儀器設(shè)備
        1.4 溶液的配制
    2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.1 CRISPR/Cas9靶向載體的設(shè)計(jì)及構(gòu)建
        2.2 sgRNA表達(dá)載體基因突變效率檢測
            2.2.1 細(xì)胞的轉(zhuǎn)染
            2.2.2 PCR、TA克隆及測序
        2.3 單細(xì)胞克隆的獲得及鑒定
        2.4 β4GalNT2基因敲除豬的制備及鑒定
        2.5 PBMC與FITC-DBA共孵育
        2.6 脫靶分析
    3 結(jié)果與分析
        3.1 CRISPR/Cas9靶向載體的構(gòu)建及基因突變效率
        3.2 單細(xì)胞克隆鑒定
        3.3 β4GalNT2基因敲除豬的制備及鑒定
        3.4 PBMC與FITC-DBA共孵育
        3.5 脫靶分析
    4 討論
第三部分 CRISPR/CAS9介導(dǎo)的ZBED6基因敲除豬制備
    1 實(shí)驗(yàn)材料
        1.1 動物性材料
        1.2 主要試劑及實(shí)驗(yàn)耗材
        1.3 主要儀器設(shè)備
        1.4 溶液的配制
    2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.1 CRISPR/Cas9靶向載體的設(shè)計(jì)及構(gòu)建
        2.2 sgRNA表達(dá)載體基因突變效率檢測
        2.3 單細(xì)胞克隆的獲得及鑒定
        2.4 ZBED6基因敲除豬的制備及鑒定
        2.5 脫靶分析
        2.6 ZBED6基因敲除豬與野生型豬的比較
    3 結(jié)果與分析
        3.1 CRISPR/Cas9靶向載體的構(gòu)建及基因突變效率
        3.2 單細(xì)胞克隆鑒定
        3.3 ZBED6基因敲除豬的制備及鑒定
        3.4 脫靶分析
        3.5 ZBED6基因敲除豬與野生型豬的比較
            3.5.1 外觀與體重比較
            3.5.2 生理指標(biāo)檢測
            3.5.3 胰島素和IGF2檢測
            3.5.4 凝血四項(xiàng)檢測
    4 討論
第四部分 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝
作者簡介
導(dǎo)師簡介



本文編號：3904667