基因編輯技術(shù)是一種能夠?qū)ι矬w基因組特定目標(biāo)基因進(jìn)行定點(diǎn)修飾的基因工程技術(shù),自問(wèn)世以來(lái)廣泛應(yīng)用于植物育種、群體改良、突變體構(gòu)建等領(lǐng)域。較大田作物而言,基因編輯技術(shù)在藥用植物中應(yīng)用較少。人參和三七為五加科人參屬極具藥用價(jià)值的代表性植物,基因編輯技術(shù)的應(yīng)用對(duì)其基因組功能研究、物質(zhì)合成調(diào)控等具有重要意義。本試驗(yàn)基于人參皂苷前體物質(zhì)2,3-氧化角鯊烯的代謝通路,構(gòu)建人參環(huán)阿喬醇合酶(CAS)和三七達(dá)瑪烯二醇合成酶(DS)基因CRISPR/Cas9表達(dá)載體。以根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化人參愈傷組織,探究共培養(yǎng)后適宜的抑菌壓和篩選壓,優(yōu)化和完善人參愈傷的遺傳轉(zhuǎn)化體系。制備產(chǎn)量和活力較高的三七原生質(zhì)體作為聚乙二醇轉(zhuǎn)導(dǎo)的受體材料。為人參和三七基因編輯體系的建立奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下:1.以pRGEB32質(zhì)粒為基本骨架,利用同源重組法將靶序列片段與線(xiàn)性化載體連接,構(gòu)建人參CAS基因和三七DS基因CRISPR/Cas9編輯載體。將pCRISPR-CAS熱激導(dǎo)入EHA105感受態(tài)細(xì)胞用于人參愈傷組織轉(zhuǎn)化。2.探究不同濃度的頭孢霉素和卡那霉素對(duì)人參愈傷組織生長(zhǎng)的影響,確定農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化中適宜的抑菌濃度和篩選...

【文章頁(yè)數(shù)】：53 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
abstract
第一章 緒論
    1.1 基因編輯技術(shù)發(fā)展歷程
        1.1.1 ZFN技術(shù)簡(jiǎn)介
        1.1.2 TALENs技術(shù)簡(jiǎn)介
        1.1.3 歸巢核酸酶技術(shù)簡(jiǎn)介
        1.1.4 CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)
    1.2 CRISPR/Cas9 作用原理及應(yīng)用
        1.2.1 CRISPR/Cas9 作用原理
        1.2.2 CRISPR/Cas9 介導(dǎo)的基因編輯技術(shù)應(yīng)用
    1.3 人參皂苷生物合成路徑及目的基因功能
        1.3.1 人參皂苷生物合成路徑
        1.3.2 環(huán)阿喬醇合酶基因
        1.3.3 達(dá)瑪烯二醇合酶基因
    1.4 研究?jī)?nèi)容及目的意義
        1.4.1 研究?jī)?nèi)容
        1.4.2 研究目的及意義
第二章 CRISPR/Cas9 載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)化
    2.1 試驗(yàn)材料
    2.2 試驗(yàn)儀器試劑
        2.2.1 主要試驗(yàn)儀器
        2.2.2 主要試驗(yàn)試劑
    2.3 試驗(yàn)方法
        2.3.1 sgRNA設(shè)計(jì)
        2.3.2 Oligo二聚體合成連接
        2.3.3 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化及保存
        2.3.4 質(zhì)粒提取
        2.3.5 質(zhì)粒轉(zhuǎn)導(dǎo)EHA105農(nóng)桿菌
    2.4 結(jié)果與分析
        2.4.1 載體構(gòu)建
        2.4.2 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌
    2.5 討論
第三章 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的人參愈傷組織轉(zhuǎn)化
    3.1 試驗(yàn)材料
    3.2 試驗(yàn)儀器試劑
        3.2.1 主要試驗(yàn)儀器
        3.2.2 主要試劑
    3.3 試驗(yàn)方法
        3.3.1 愈傷組織繼代培養(yǎng)
        3.3.2 Cef對(duì)人參愈傷組織生長(zhǎng)的影響
        3.3.3 Cef對(duì) EHA105 菌液生長(zhǎng)的影響
        3.3.4 Kan對(duì)人參愈傷組織生長(zhǎng)的影響
        3.3.5 農(nóng)桿菌侵染愈傷組織
        3.3.6 共培養(yǎng)后材料脫菌培養(yǎng)
        3.3.7 陽(yáng)性材料初步篩選
    3.4 結(jié)果與分析
        3.4.1 不同濃度Cef對(duì)人參愈傷組織生長(zhǎng)的影響
        3.4.2 Cef對(duì) EHA105 菌液生長(zhǎng)的影響
        3.4.3 愈傷組織侵染及脫菌培養(yǎng)
        3.4.4 Kan對(duì)人參愈傷組織生長(zhǎng)的影響
        3.4.5 陽(yáng)性材料初步篩選及檢測(cè)
    3.5 討論
第四章 三七原生質(zhì)體制備
    4.1 試驗(yàn)材料
    4.2 試驗(yàn)儀器試劑
        4.2.1 主要試驗(yàn)儀器
        4.2.2 主要試劑
    4.3 試驗(yàn)方法
        4.3.1 三七原生質(zhì)體分離純化
        4.3.2 原生質(zhì)體產(chǎn)量計(jì)算及活力檢測(cè)
        4.3.3 不同培養(yǎng)天數(shù)對(duì)原生質(zhì)體產(chǎn)量和活力影響
        4.3.4 不同離心力對(duì)原生質(zhì)體產(chǎn)量和完整度的影響
        4.3.5 不同滲透壓對(duì)原生質(zhì)體分離的影響
        4.3.6 不同酶解時(shí)間對(duì)原生質(zhì)體分離的影響
        4.3.7 不同酶液配比對(duì)原生質(zhì)體分離的影響
    4.4 結(jié)果與分析
        4.4.1 不同培養(yǎng)天數(shù)對(duì)原生質(zhì)體產(chǎn)量和活力影響
        4.4.2 不同離心力對(duì)原生質(zhì)體產(chǎn)量和完整度的影響
        4.4.3 不同滲透壓對(duì)原生質(zhì)體分離的影響
        4.4.4 不同酶解時(shí)間對(duì)原生質(zhì)體分離的影響
        4.4.5 不同酶液配比對(duì)原生質(zhì)體分離的影響
    4.5 討論
第五章 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
附錄A
附錄B
附錄C
附錄D
致謝
作者簡(jiǎn)歷



本文編號(hào)：3897194