本文關(guān)鍵詞：抑制肺鱗癌細(xì)胞FANCM和USP1基因?qū)樸K的增敏效應(yīng)，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:DNA損傷修復(fù)是腫瘤細(xì)胞對(duì)鉑類藥物耐藥的重要機(jī)制,FA/BRCA通路在鉑類藥物所致細(xì)胞DNA損傷的修復(fù)中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。本研究通過抑制人肺鱗癌細(xì)胞SK-MES-1株FA/BRCA通路上游蛋白FANCM和去泛素化蛋白USP1,觀察FA/BRCA通路激活狀態(tài),探討這些干預(yù)對(duì)化療藥物順鉑(DDP)敏感性的影響。方法:體外培養(yǎng)人肺鱗癌SK-MES-1細(xì)胞,按照脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒說明書介紹的程序?qū)⑻禺愋葬槍?duì)FANCM和USP1基因的si RNA(FANCM-si RNA和USP1-si RNA)分別和共轉(zhuǎn)染于SK-MES-1細(xì)胞株。采用蛋白質(zhì)印跡法(Western Blot)測定轉(zhuǎn)染后FANCM和USP1蛋白表達(dá)以驗(yàn)證si RNA轉(zhuǎn)染效率確保轉(zhuǎn)染成功;Annexin V/PI流式細(xì)胞術(shù)測定轉(zhuǎn)染前后SK-MES-1細(xì)胞經(jīng)10μg/ml DDP處理24h后的早期凋亡率變化;CCK-8(Cell Counting Kit-8)法測定轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞經(jīng)10μg/ml DDP處理24h和48h后的生存率;蛋白質(zhì)印跡法檢測轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞經(jīng)不同濃度梯度DDP處理后FANCD2蛋白單泛素化水平,以及免疫熒光染色檢測轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞核內(nèi)FANCD2核聚小體的表達(dá)狀態(tài)。結(jié)果:(1)SK-MES-1細(xì)胞分別經(jīng)FANCM-siRNA和USP1-siRNA轉(zhuǎn)染后,與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組比較,FANCM蛋白和USP1蛋白表達(dá)均明顯降低(兩者均P0.05),表明FANCM-si RNA轉(zhuǎn)染和USP1-si RNA轉(zhuǎn)染皆有效;(2)肺鱗癌細(xì)胞SK-MES-1分別轉(zhuǎn)染和雙轉(zhuǎn)染FANCM-si RNA和USP1-si RNA后,用10μg/ml DDP處理24h,流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示細(xì)胞的早期凋亡率明顯高于未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。但轉(zhuǎn)染USP1-si RNA的細(xì)胞早期凋亡率高于轉(zhuǎn)染FANCM-si RNA的細(xì)胞。USP1-si RNA和FANCM-si RNA雙轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞早期凋亡率明顯高于單轉(zhuǎn)染FANCM-si RNA細(xì)胞的早期凋亡率(P0.05),而與單轉(zhuǎn)染USP1-si RNA細(xì)胞的早期凋亡率比較無明顯差異(P0.05)。(3)肺鱗癌細(xì)胞SK-MES-1分別轉(zhuǎn)染和雙轉(zhuǎn)染FANCM-si RNA和USP1-si RNA后,用10μg/ml DDP分別處理24h和48h,細(xì)胞生存率和半數(shù)抑制率(IC50)明顯下降,與未轉(zhuǎn)染組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);轉(zhuǎn)染USP1-si RNA細(xì)胞的生存率低于轉(zhuǎn)染FANCM-si RNA的細(xì)胞(P0.05)。USP1-si RNA和FANCM-si RNA雙轉(zhuǎn)染后經(jīng)DDP處理24h和48h的細(xì)胞生存率和IC50明顯低于單轉(zhuǎn)染FANCM-si RNA細(xì)胞生存率(P0.05),而與單轉(zhuǎn)染USP1-si RNA細(xì)胞生存率比較無明顯差異(P0.05)。(4)肺鱗癌SK-MES-1細(xì)胞經(jīng)FANCM-si RNA轉(zhuǎn)染并經(jīng)DDP處理后,以FANCD2-L/S比值所表示的FANCD2單泛素化水平下調(diào),同時(shí)胞核內(nèi)的FANCD2核聚小體表達(dá)降低,提示FA/BRCA通路上游基因FANCM沉默導(dǎo)致FANCD2單泛素化受抑制。轉(zhuǎn)染USP1-si RNA后,DDP誘導(dǎo)的FANCD2單泛素化水平上調(diào),核內(nèi)FANCD2核聚小體表達(dá)增強(qiáng),提示FANCD2去泛素化酶USP1被抑制后,造成單泛素化的FANCD2堆積。此外,雙轉(zhuǎn)染FANCM-si RNA和USP1-si RNA后,DDP誘導(dǎo)的細(xì)胞FANCD2單泛素化水平明顯高于單轉(zhuǎn)染FANCM-si RNA的細(xì)胞,但低于單轉(zhuǎn)染USP1-si RNA的細(xì)胞,胞核內(nèi)FANCD2核聚小體表達(dá)無明顯改變,這一結(jié)果的機(jī)制如上所述。結(jié)論:沉默F(xiàn)ANCM基因后通過抑制FA/BRCA通路FANCD2蛋白單泛素化,使得FA/BRCA通路下游蛋白不能被激活,從而無法對(duì)DDP誘導(dǎo)的DNA損傷實(shí)施修復(fù);沉默USP1基因后可使FANCD2去泛素化受抑制,導(dǎo)致已泛素化的FANCD2在細(xì)胞內(nèi)堆積,亦不能激活FA/BRCA通路下游蛋白。兩者都可阻斷FA/BRCA通路,抑制DNA損傷修復(fù),導(dǎo)致SK-MES-1細(xì)胞對(duì)DDP的敏感性增高,值得注意的是沉默USP1基因后對(duì)DDP的增敏效應(yīng)更為明顯。
【關(guān)鍵詞】：肺鱗癌細(xì)胞 FA/BRCA通路 順鉑 FANCM USP1 si RNA
【學(xué)位授予單位】：江蘇大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R734.2
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-14
• 第一章 緒論14-21
• 1.1 前言14-17
• 1.2 研究目的、方法、實(shí)驗(yàn)方案和意義17-21
• 1.2.1 研究目的17-18
• 1.2.2 研究主要內(nèi)容和方法18-19
• 1.2.3 實(shí)驗(yàn)方案和路徑19-20
• 1.2.4 研究意義20-21
• 第二章 蛋白印跡法驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效率，F(xiàn)ANCM和USP1基因沉默對(duì)DDP誘導(dǎo)SK-MES-1 細(xì)胞凋亡率的影響21-34
• 2.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象與實(shí)驗(yàn)器材21-24
• 2.1.1 細(xì)胞株21
• 2.1.2 主要儀器21-22
• 2.1.3 常用試劑22-23
• 2.1.4 常用試劑制備方法23-24
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法與技術(shù)24-30
• 2.2.1 細(xì)胞復(fù)蘇、培養(yǎng)、傳代、計(jì)數(shù)24-25
• 2.2.2 蛋白印跡法檢測SK-MES-1 細(xì)胞株FANCM和USP1沉默后蛋白的表達(dá)25-28
• 2.2.3 Annexin V/PI流式細(xì)胞術(shù)分別檢測SK-MES-1 細(xì)胞株FANCM和USP1基因沉默，及兩個(gè)基因共沉默后的細(xì)胞凋亡率28-29
• 2.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析29-30
• 2.3 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與結(jié)果30-33
• 2.3.1 沉默F(xiàn)ANCM和USP1基因后SK-MES-1 細(xì)胞FANCM和USP1蛋白表達(dá)30-31
• 2.3.2 沉默F(xiàn)ANCM和USP1基因及兩個(gè)基因共沉默后SK-MES-1 細(xì)胞早期凋亡率的變化31-33
• 2.4 數(shù)據(jù)與結(jié)果分析33-34
• 第三章 FANCM和USP1基因沉默對(duì)DDP誘導(dǎo)的SK-MES-1 細(xì)胞生存率的影響34-41
• 3.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象與實(shí)驗(yàn)材料34-35
• 3.1.1 細(xì)胞株34
• 3.1.2 主要儀器34
• 3.1.3 常用試劑34-35
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法與技術(shù)35-37
• 3.2.1 處理實(shí)驗(yàn)細(xì)胞35-36
• 3.2.2 CCK-8 法測定SK-MES-1 細(xì)胞FANCM和USP1基因沉默，及兩個(gè)基因共沉默后的細(xì)胞生存率36
• 3.2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析36-37
• 3.3 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與結(jié)果37-40
• 3.3.1 分別沉默F(xiàn)ANCM和USP1基因及兩個(gè)基因共沉默前后順鉑抑制SK-MES-1 細(xì)胞生存率的變化37-39
• 3.3.2 分別沉默F(xiàn)ANCM和USP1基因及兩個(gè)基因共沉默后SK-MES-1 細(xì)胞株半數(shù)抑制濃度的變化39-40
• 3.4 數(shù)據(jù)與結(jié)果分析40-41
• 第四章 FANCM和USP1基因沉默對(duì)DDP誘導(dǎo)SK-MES-1 細(xì)胞FANCD2單泛素化和核聚小體表達(dá)的影響41-52
• 4.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象與實(shí)驗(yàn)材料41-42
• 4.1.1 細(xì)胞株41
• 4.1.2 主要儀器41
• 4.1.3 常用試劑41-42
• 4.1.4 常用試劑制備方法42
• 4.2 實(shí)驗(yàn)方法與技術(shù)42-47
• 4.2.1 蛋白質(zhì)印記法檢測SK-MES-1 細(xì)胞株FANCM和USP1基因沉默，及兩個(gè)基因共沉默后FANCD2蛋白表達(dá)和單泛素化水平42-45
• 4.2.2 免疫熒光法觀察SK-MES-1 細(xì)胞株FANCM和USP1基因沉默，及兩個(gè)基因共沉默后核聚小體的表達(dá)45-47
• 4.3 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與結(jié)果47-50
• 4.3.1 沉默F(xiàn)ANCM和USP1基因及兩個(gè)基因共沉默后SK-MES-1 細(xì)胞FANCD2蛋白表達(dá)和單泛素化水平47-50
• 4.3.2 沉默F(xiàn)ANCM和USP1基因及兩個(gè)基因共沉默后SK-MES-1 細(xì)胞核聚小體的表達(dá)變化50
• 4.4 數(shù)據(jù)與結(jié)果分析50-52
• 討論52-58
• 結(jié)論與展望58-60
• 參考文獻(xiàn)60-66
• 泛素化/去泛素化與腫瘤發(fā)生發(fā)展的研究進(jìn)展（綜述）66-74
• 參考文獻(xiàn)70-74
• 致謝74-75
• 攻讀碩士期間發(fā)表的論文75

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