組織蛋白酶H(Cathepsin H)是溶酶體半胱氨酸蛋白酶家族的重要成員,是木瓜蛋白酶樣家族中唯一己知的單氨基肽酶,其表達(dá)水平在活化的免疫細(xì)胞中增加,與其他組織蛋白酶一樣,在許多重要的細(xì)胞中發(fā)揮核心作用,例如降解細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)、活化溶酶體內(nèi)其他蛋白酶、重塑細(xì)胞外基質(zhì)和參與細(xì)胞凋亡等。目前,關(guān)于猴Cathepsin H基因是否影響偽狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)的復(fù)制尚未見研究報(bào)道。為了建立穩(wěn)定且高效抑制猴Cathepsin H基因表達(dá)的MARC-145細(xì)胞,我們利用小干擾RNA技術(shù)靶向Cathepsin H基因。我們還檢測了敲減Cathepsin H對(duì)PRV病毒復(fù)制的影響。運(yùn)用熒光顯微鏡觀察、流式細(xì)胞儀、病毒滴度測定、熒光定量PCR、蛋白免疫印跡等手段檢測PRV在shCathepsin H MARC-145細(xì)胞中增殖。結(jié)果表明,隨著PRV-GFP感染時(shí)間的延長,shCathepsin H細(xì)胞中GFP的熒光強(qiáng)度顯著低于shControl細(xì)胞,表明敲減Cathepsin H抑制PRV復(fù)制。進(jìn)一步用PRV-QXX感染shControl和shCathepsin H細(xì)胞...

【文章頁數(shù)】：49 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
致謝
英文縮略表
摘要
1. 文獻(xiàn)綜述
    1.1 偽狂犬病(PR)
        1.1.1 偽狂犬病
        1.1.2 偽狂犬病毒(PRV)的生物學(xué)特性
        1.1.3 PRV感染與宿主天然免疫
    1.2 組織蛋白酶
        1.2.1 組織蛋白酶概述
        1.2.2 組織蛋白酶的分類及主要特性
        1.2.3 組織蛋白酶的結(jié)構(gòu)和定位
        1.2.4 組織蛋白酶的生理學(xué)功能
        1.2.5 組織蛋自酶與病毒的復(fù)制
    1.3 組織蛋白酶 H(Cathepsin H)
        1.3.1 Cathepsin H概述
        1.3.2 Cathepsin H生物學(xué)功能
        1.3.3 Cathepsin H結(jié)構(gòu)
        1.3.4 Cathepsin H與疾病的發(fā)展
    1.4 RNA干擾技術(shù)(RNA interference,RNAi)
        1.4.1 RNAi概述
        1.4.2 RNAi的原理
        1.4.3 RNAi的特征
        1.4.4 RNAi的應(yīng)用
    1.5 展望
2. 引言
3. 材料與方法
    3.1 材料
        3.1.1 細(xì)胞和病毒
        3.1.2 抗體
        3.1.3 細(xì)胞培養(yǎng)耗材
        3.1.4 感受態(tài)和質(zhì)粒
        3.1.5 主要儀器設(shè)備
        3.1.6 主要試劑
        3.1.7 常規(guī)生化試劑的配制
    3.2 試驗(yàn)方法
        3.2.1 CaCl₂法制備E.coli Top10感受態(tài)細(xì)胞
        3.2.2 引物設(shè)計(jì)與合成
            3.2.2.1 shRNA引物設(shè)計(jì)與合成
            3.2.2.2 Q-PCR克隆引物設(shè)計(jì)與合成
        3.2.3 猴源Cathepsin H基因shRNA重組質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定
        3.2.4 質(zhì)粒提取
        3.2.5 慢病毒包裝及穩(wěn)定敲減MARC-145細(xì)胞系構(gòu)建
        3.2.6 RNA提取
        3.2.7 RNA反轉(zhuǎn)錄
        3.2.8 熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測
        3.2.9 熒光觀察
        3.2.10 流式細(xì)胞術(shù)
        3.2.11 PRV病毒滴度測定
        3.2.12 Western Blot檢測
            3.2.12.1 蛋白的收取(60 mm dish)
            3.2.12.2 BCA蛋白含量測定
            3.2.12.3 SDS-PAGE膠電泳
            3.2.12.4 濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜(PVDF膜)
        3.2.13 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
4 結(jié)果與分析
    4.1 猴源cathepsin基因敲減MARC-145細(xì)胞系構(gòu)建
    4.2 猴源cathepsin基因敲減對(duì)PRV-GFP復(fù)制的影響
    4.3 猴源cathepsin基因敲減對(duì)PRV-gE蛋白表達(dá)的影響
    4.4 猴源cathepsin H基因shRNA重組質(zhì)粒構(gòu)建及鑒定
    4.5 猴源cathepsin H基因敲減MARC-145細(xì)胞系敲減效率檢測
    4.6 猴源cathepsin H基因敲減對(duì)PRV-GFP復(fù)制的影響
    4.7 猴源cathepsin H基因敲減對(duì)PRV-QXX滴度的影響
    4.8 猴源cathepsin H基因敲減對(duì)PRV基因gB、TK轉(zhuǎn)錄的影響
    4.9 猴源cathepsin H基因敲減對(duì)PRV-gE蛋白表達(dá)的影響
5 討論與結(jié)論
    5.1 討論
    5.2 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
英文摘要



本文編號(hào)：3847190