植物體作為固著物在生長發(fā)育期間會受到諸多非生物脅迫因素的影響。隨著工業(yè)化的發(fā)展,大量溫室氣體排放導致環(huán)境溫度在不斷提高。這些使大量植物不得不通過改變自身遺傳調(diào)節(jié)機制來提高對惡劣環(huán)境的耐受性,以此增加存活率。而植物提高自身在脅迫環(huán)境下耐受力的主要方式是通過DNA甲基化等表觀遺傳手段。DNA甲基化主要是在甲基轉(zhuǎn)移酶的催化下修飾基因組DNA來響應外界環(huán)境的脅迫,其中參與植物中DNA甲基化起始的主要DNA甲基轉(zhuǎn)移酶是DRM2。DRM2在植物耐受性方面的研究較為全面,比如擬南芥DRM2在鹽脅迫耐受性的研究中,結(jié)果表明DNA甲基轉(zhuǎn)移酶可能間接促進纖維素合成酶的表達進而調(diào)控纖維素合成的水平,最終賦予擬南芥鹽脅迫的耐受性。在茶樹也有類似的發(fā)現(xiàn),通過改變Cs DRM2基因的表達水平使得基因組甲基化發(fā)生變化,以此參與茶樹對低溫脅迫的響應。本研究通過NCBI數(shù)據(jù)庫,在番茄(Solanum lycopersicum)中發(fā)現(xiàn)了一個與擬南芥胞嘧啶甲基轉(zhuǎn)移酶DRM2同源性較高的序列,即SlDRM2L。通過Gen Bank(登錄號NM＿001246974)獲得番茄DNA甲基轉(zhuǎn)移酶SlDRM2L基因的c DNA全長序列...

【文章頁數(shù)】：86 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
致謝
摘要
abstract
第一章 緒論
    1.1 番茄生物學地位
    1.2 表觀遺傳學
        1.2.1 動物表觀遺傳學
        1.2.2 植物表觀遺傳學
    1.3 DNA甲基化
        1.3.1 DNA甲基化
        1.3.2 植物的DNA甲基化
        1.3.3 域重排甲基轉(zhuǎn)移酶(DRM)
    1.4 非生物因素脅迫
        1.4.1 非生物因素
        1.4.2 高溫熱脅迫
    1.5 泛素結(jié)合結(jié)構(gòu)域
        1.5.1 UBA結(jié)構(gòu)域
    1.6 轉(zhuǎn)基因技術(shù)
        1.6.1 轉(zhuǎn)基因
        1.6.2 農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)化
    1.7 課題研究的目的及意義
第二章 材料與方法
    2.1 實驗材料
        2.1.1 植物材料
        2.1.2 載體及菌株材料
        2.1.3 引物設計序列
        2.1.4 常用生化試劑
    2.2 培養(yǎng)基配置
        2.2.1 載體構(gòu)建相關(guān)實驗培養(yǎng)基
        2.2.2 番茄轉(zhuǎn)基因技術(shù)相關(guān)培養(yǎng)基及生化試劑配置
        2.2.3 煙草瞬時表達誘導液
    2.3 實驗室儀器、設備
    2.4 實驗方法
        2.4.1 Trizol法提取野生型番茄RNA
        2.4.2 反轉(zhuǎn)錄獲cDNA
    2.5 載體構(gòu)建
        2.5.1 設計引物
        2.5.2 稀釋引物
        2.5.3 目的基因獲得
        2.5.4 瓊脂糖凝膠電泳
        2.5.5 PCR產(chǎn)物純化
        2.5.6 雙酶切反應
        2.5.7 連接反應
        2.5.8 制備大腸桿菌感受態(tài)
        2.5.9 大腸桿菌DH5a轉(zhuǎn)化
        2.5.10 陽性菌鑒定
        2.5.11 質(zhì)粒DNA提取
        2.5.12 測序及分析
        2.5.13 農(nóng)桿菌感受態(tài)制備
        2.5.14 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化
        2.5.15 陽性農(nóng)桿菌的儲存
    2.6 基因沉默載體構(gòu)建
    2.7 SlDRM2L基因亞細胞定位分析
        2.7.1 融合表達載體構(gòu)建
        2.7.2 煙草瞬時表達
            2.7.2.1 注射誘導液制備
            2.7.2.2 激光共聚焦顯微鏡觀察
    2.8 SlDRM2L基因在不同組織的表達情況
        2.8.1 反轉(zhuǎn)錄cDNA
        2.8.2 熒光定量PCR
    2.9 植物轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?br>        2.9.1 番茄組織培養(yǎng)
        2.9.2 農(nóng)桿菌介導的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)
        2.9.3 抗生素篩選及生根
        2.9.4 煉苗培養(yǎng)
        2.9.5 陽性植株鑒定
            2.9.5.1 使用CTAB法提取葉片的DNA
            2.9.5.2 RNA水平陽性植株的鑒定
        2.9.6 轉(zhuǎn)基因陽性苗移栽培養(yǎng)
        2.9.7 收集番茄果實
        2.9.8 CTAB法提取果實DNA
        2.9.9 亞硫酸氫鈉測序法分析DNA甲基化水平
    2.10 高溫下SlDRM2L基因的表達水平
    2.11 檢測高溫響應基因半定量
第三章 實驗結(jié)果與分析
    3.1 生物信息學分析
        3.1.1 番茄SlDRM2L基因
        3.1.2 番茄SlDRM2L結(jié)構(gòu)域分析
        3.1.3 番茄SlDRM2L蛋白質(zhì)理化分析
        3.1.4 進化樹分析
    3.2 SlDRM2L蛋白亞細胞定位分析
        3.2.1 構(gòu)建融合表達載體
    3.3 SlDRM2L基因表達模式分析
    3.4 番茄SlDRM2L受高溫誘導分析
    3.5 番茄cDNA及目的基因的獲得
        3.5.1 目的基因獲取
        3.5.2 特異性基因片段的獲取
        3.5.3 pSK-SiRNA1 陽性鑒定
        3.5.4 pSK-SiRNA1-SiRNA2 陽性鑒定
        3.5.5 基因沉默表達載體鑒定
        3.5.6 農(nóng)桿菌陽性鑒定
    3.6 轉(zhuǎn)基因番茄制備
        3.6.1 番茄組織培養(yǎng)
        3.6.2 番茄組織培養(yǎng)
        3.6.3 農(nóng)桿菌介導侵染
        3.6.4 卡納霉素(Kana)梯度篩選與愈傷分化
        3.6.5 生根培養(yǎng)
        3.6.6 煉苗
        3.6.7 DNA及轉(zhuǎn)錄水平陽性鑒定
        3.6.8 果實重量及大小比較
        3.6.9 MuDR轉(zhuǎn)座子啟動子區(qū)域甲基化水平檢測
    3.7 參與高溫響應基因鑒定分析
第四章 結(jié)論與討論
    4.1 結(jié)論
    4.2 討論與展望
參考文獻
攻讀碩士學位期間發(fā)表論文及參與項目



本文編號：3838187