MinE蛋白在質(zhì)體分裂中起著關(guān)鍵作用。本研究從木薯(Manihot esculenta Crantz)基因組中分離出MinE基因(MeMinE),并對其進(jìn)行相關(guān)生物信息學(xué)分析及木薯不同部位特異性表達(dá)分析。高濃度及高活力的木薯葉肉原生質(zhì)體被分離純化出來,并成功地在木薯葉肉原生質(zhì)體中進(jìn)行GFP融合的MeMinE蛋白的瞬時表達(dá)。結(jié)果顯示MeMinE蛋白定位于葉綠體上,且木薯葉肉原生質(zhì)體中MeMinE蛋白的過量表達(dá)可導(dǎo)致木薯葉肉原生質(zhì)體中葉綠體的數(shù)量和大小顯著減小。在大腸桿菌中MeMinE蛋白的過量表達(dá)也會造成大腸桿菌的不正常分裂,造成細(xì)胞兩級異常分裂進(jìn)而導(dǎo)致小細(xì)胞的出現(xiàn)。通過轉(zhuǎn)基因技術(shù),將重組工程菌pCAMBIA1300 eGFP-MeMinE轉(zhuǎn)化木薯華南8號(SC8)體細(xì)胞子葉胚,獲得MeMinE過表達(dá)的幼苗。本研究比較了木薯和馬鈴薯淀粉顆粒的形狀,直徑和分子量大小的差異。結(jié)果顯示木薯淀粉顆粒通常呈現(xiàn)多面體并且一端被截斷的形狀,而馬鈴薯淀粉顆粒呈現(xiàn)規(guī)則的橢圓形。木薯淀粉顆粒的直徑大多處在0-20μm之間,而馬鈴薯淀粉顆粒的直徑大多處在740μm之間。木薯淀粉顆粒的平均直徑比馬鈴薯淀粉顆粒的...

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【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
abstract
1 前言
    1.1 木薯的研究背景及意義
    1.2 葉綠體的產(chǎn)生及分裂
    1.3 Min系統(tǒng)在原核細(xì)胞分裂中的調(diào)控
    1.4 原生質(zhì)體的瞬時基因表達(dá)
    1.5 木薯遺傳轉(zhuǎn)化體系的研究進(jìn)展
    1.6 淀粉的構(gòu)成及作用
    1.7 淀粉含量測定研究進(jìn)展
    1.8 本研究的目的和意義
    1.9 技術(shù)路線
2 木薯MinE基因生物信息學(xué)分析
    2.1 木薯MinE基因結(jié)構(gòu)分析
    2.2 MinE蛋白多序列比對
    2.3 木薯MinE蛋白三維結(jié)構(gòu)預(yù)測
    2.4 MinE蛋白進(jìn)化樹分析
3 qPCR檢測MinE基因在木薯生長不同階段及不同部位表達(dá)量
    3.1 材料
        3.1.1 植物材料
        3.1.2 試劑盒
        3.1.3 主要儀器設(shè)備
    3.2 方法
        3.2.1 RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄
        3.2.2 引物的設(shè)計
        3.2.3 PCR程序
    3.3 結(jié)果分析
        3.3.1 不同生長階段差異表達(dá)分析
        3.3.2 不同部位差異表達(dá)分析
    3.4 討論
4 木薯MinE基因的克隆及兩種表達(dá)載體的構(gòu)建
    4.1 材料
        4.1.1 植物材料
        4.1.2 菌株及質(zhì)粒
        4.1.3 工具酶與試劑盒
        4.1.4 主要儀器及設(shè)備
        4.1.5 培養(yǎng)基及相關(guān)溶液的配制
    4.2 方法
        4.2.1 木薯SC8組培苗的獲取
        4.2.2 RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄
        4.2.3 引物的設(shè)計
        4.2.4 RT-PCR反應(yīng)
        4.2.5 目的條帶的純化
        4.2.6 目的片段和質(zhì)粒的酶切、純化、連接
        4.2.7 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌
        4.2.8 菌落PCR驗(yàn)證
        4.2.9 重組質(zhì)粒的提取,雙酶切及測序驗(yàn)證
        4.2.10 植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101及陽性克隆篩選
        4.2.11 原核表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)及陽性克隆篩選
    4.3 結(jié)果分析
        4.3.1 木薯組培苗的獲取
        4.3.2 RNA條帶跑膠驗(yàn)證、RT-PCR驗(yàn)證及菌液PCR驗(yàn)證
        4.3.3 重組質(zhì)粒雙酶切及測序驗(yàn)證
    4.4 討論
5 木薯原生質(zhì)體的分離
    5.1 材料
        5.1.1 植物材料
        5.1.2 試劑配制
        5.1.3 主要儀器設(shè)備
    5.2 方法
        5.2.1 植物材料的選取
        5.2.2 葉片的酶解
        5.2.3 原生質(zhì)體的純化,及FDA染色檢測原生質(zhì)體的活性
    5.3 結(jié)果分析
        5.3.1 原生質(zhì)體數(shù)量及活力的鏡檢
    5.4 討論
6木薯葉肉原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)染及MinE蛋白過表達(dá)對葉綠體分裂影響
    6.1 材料
        6.1.1 植物材料
        6.1.2 試劑及培養(yǎng)基配制
        6.1.3 試劑盒及主要儀器設(shè)備
    6.2 方法
        6.2.1 無內(nèi)毒素質(zhì)粒大提
        6.2.2 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染原生質(zhì)體
        6.2.3 共焦距顯微鏡的使用
    6.3 結(jié)果分析
        6.3.1 無融合GFP蛋白及MinE-eGFP融合蛋白的定位
        6.3.2 MinE蛋白對葉綠體分裂的影響
    6.4 討論
7 大腸桿菌原核表達(dá)
    7.1 材料
        7.1.1 菌株
        7.1.2 試劑及培養(yǎng)基的配制
        7.1.3 主要儀器
    7.2 方法
    7.3 結(jié)果分析
        7.3.1 MinE蛋白的過表達(dá)對大腸桿菌分裂的影響
    7.4 討論
8 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)化
    8.1 材料
        8.1.1 植物材料
        8.1.2 試劑及培養(yǎng)基的配制
        8.1.3 主要儀器及設(shè)備
    8.2 方法
        8.2.1 體胚的誘導(dǎo)及繼代
        8.2.2 子葉胚的誘導(dǎo)
        8.2.3 轉(zhuǎn)化
        8.2.4 抗性芽的篩選
    8.3 結(jié)果分析
    8.4 討論
9 電鏡掃描
    9.1 材料
        9.1.1 主要儀器
    9.2 方法
        9.2.1 樣本的制備
        9.2.2 掃描電鏡的使用
    9.3 結(jié)果分析
    9.4 討論
10 木薯直鏈淀粉及支鏈淀粉的分離及純化
    10.1 材料
        10.1.1 淀粉材料
        10.1.2 試劑
        10.1.3 主要儀器
    10.2 方法
        10.2.1 原淀粉的提取
        10.2.2 索氏提取器的改良
        10.2.3 直鏈淀粉及支鏈淀粉的分離純化
        10.2.4 淀粉純度的測定
    10.3 結(jié)果分析
    10.4 討論
11 雙波長碘結(jié)合法中標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
    11.1 材料
        11.1.1 淀粉材料
        11.1.2 試劑及溶液的配制
        11.1.3 主要儀器
    11.2 方法
        11.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配置
        11.2.2 測定波長的選取
        11.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線及淀粉含量測定公式的確定
    11.3 結(jié)果分析
    11.4 討論
12 雙波長法及Megazyme試劑盒法測木薯淀粉標(biāo)品準(zhǔn)混合物含量
    12.1 材料
        12.1.1 木薯材料
        12.1.2 試劑及相關(guān)溶液的配置
        12.1.3 主要儀器及設(shè)備
    12.2 方法
        12.2.1 木薯直鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)品混合物的配置
        12.2.2 雙波長法測木薯直鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)品混合物淀粉含量
        12.2.3 Megazyme試劑盒法測木薯淀粉標(biāo)準(zhǔn)品混合物淀粉含量
    12.3 結(jié)果分析
13 雙波長法及Megazyme試劑盒法測田間木薯及土豆各品種淀粉含量
    13.1 材料
        13.1.1 田間材料的獲取及處理
        13.1.2 試劑及相關(guān)溶液的配置
        13.1.3 主要儀器及設(shè)備
    13.2 方法
        13.2.1 雙波長法測田間木薯及土豆各品種淀粉含量
        13.2.2 Megazyme試劑盒法測田間木薯及土豆各品種淀粉含量
    13.3 結(jié)果分析
    13.4 討論
14 研究結(jié)論
參考文獻(xiàn)
附錄
致謝



本文編號：3832477