微生物是天然產(chǎn)物的重要來源,隨著合成生物學(xué)的快速發(fā)展和基因組測序技術(shù)的進(jìn)步,越來越多的微生物基因組測序工作已完成,人們在這些微生物基因組發(fā)現(xiàn)了大量的微生物次級代謝產(chǎn)物生物合成基因簇尚未被開發(fā)和研究,但是很多微生物很難進(jìn)行遺傳操作或者在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)無法培養(yǎng)。將基因簇轉(zhuǎn)入遺傳背景清晰、易操作的宿主菌進(jìn)行異源表達(dá)是開發(fā)生物合成資源的一種重要手段。但是微生物次級代謝產(chǎn)物基因簇一般大于20 kb,很難通過PCR的方式獲得。獲得基因簇的傳統(tǒng)方法是構(gòu)建基因組文庫,但是周期長、操作復(fù)雜,不能滿足高通量克隆基因簇的要求。符軍等于2012年根據(jù)RecE和RecT蛋白能高效介導(dǎo)線性DNA分子之間發(fā)生同源重組的特性,開發(fā)了能夠?qū)⒛康腄NA片段從基因組直接捕獲至載體上的直接克隆技術(shù)。目前RecET直接克隆技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于次級代謝產(chǎn)物基因簇的異源表達(dá)研究。次級代謝產(chǎn)物在異源表達(dá)時(shí)經(jīng)常需要對表達(dá)載體進(jìn)行修飾以添加基因轉(zhuǎn)移元件、插入正調(diào)控基因、敲除負(fù)調(diào)控基因等�；诿盖泻瓦B接的傳統(tǒng)DNA重組方法由于受到酶切位點(diǎn)和DNA分子大小的限制,難以完成這些遺傳修飾。張友明等于1998年利用大腸桿菌Redαβ蛋白能夠高效介導(dǎo)線性D...

【文章頁數(shù)】：158 頁

【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
縮略詞中英文對照表
第1章 序論
    1.1 天然產(chǎn)物的生物合成
        1.1.1 聚酮合酶
        1.1.2 非核糖體肽合成酶
    1.2 DNA重組
        1.2.1 Red/ET同源重組
        1.2.2 位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)
        1.2.3 轉(zhuǎn)座重組系統(tǒng)
        1.2.4 ccdB反向篩選系統(tǒng)
    1.3 天然產(chǎn)物生物合成基因簇的挖掘與激活
        1.3.1 原位激活生物合成基因簇
        1.3.2 異源表達(dá)生物合成基因簇
        1.3.3 插入啟動(dòng)子激活生物合成基因簇
        1.3.4 宏基因中生物合成基因簇的研究進(jìn)展
    1.4 本課題開展思路與研究內(nèi)容
第2章 構(gòu)建生物合成基因簇克隆、修飾和異源表達(dá)的平臺
    2.1 引言
    2.2 實(shí)驗(yàn)材料
        2.2.1 本研究所用菌株和質(zhì)粒
        2.2.2 分子生物學(xué)試劑
        2.2.3 寡核苷酸合成和DNA測序
        2.2.4 DNA序列分析軟件
        2.2.5 儀器設(shè)備
    2.3 細(xì)菌基因組的提取實(shí)驗(yàn)方法
        2.3.1 Red/ET同源重組標(biāo)準(zhǔn)遺傳操作程序
    2.4 結(jié)果與分析
        2.4.1 構(gòu)建多功能、可控的大腸桿菌宿主
        2.4.2 構(gòu)建了標(biāo)準(zhǔn)化的直接克隆載體
        2.4.3 構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)化的鏈霉菌結(jié)合轉(zhuǎn)移和整合元件
        2.4.4 構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)化的革蘭氏陰性菌轉(zhuǎn)移和轉(zhuǎn)座元件
        2.4.5 構(gòu)建了標(biāo)準(zhǔn)化的革蘭氏陰性菌廣譜型復(fù)制子元件
    2.5 本章討論
        2.5.1 Red/ET同源重組直接克隆和修飾基因簇的優(yōu)越性與缺點(diǎn)
        2.5.2 直接克隆載體的選擇與制備
        2.5.3 轉(zhuǎn)座和結(jié)合轉(zhuǎn)移元件的選擇
        2.5.4 直接克隆中遇到的問題及解決方法
第3章 波賽鏈霉菌ATCC 27952中基因簇直接克隆與異源表達(dá)
    3.1 引言
    3.2 實(shí)驗(yàn)材料
        3.2.1 本研究所用菌株和質(zhì)粒
        3.2.2 分子生物學(xué)試劑
        3.2.3 寡核苷酸合成和DNA測序
    3.3 實(shí)驗(yàn)方法
        3.3.1 波賽鏈霉菌ATCC 27952基因簇信息的分析
        3.3.2 波賽鏈霉菌ATCC 27952基因組的提取與酶切
        3.3.3 構(gòu)建直接克隆載體
        3.3.4 用RecET同源重組技術(shù)直接克隆Cluster7
        3.3.5 利用Redαβ同源重組技術(shù)添加結(jié)合轉(zhuǎn)移元件
        3.3.6 利用Redαβ同源重組技術(shù)添加啟動(dòng)子
        3.3.7 基因簇的接合轉(zhuǎn)移
        3.3.8 鏈霉菌重組子檢測
        3.3.9 鏈霉菌重組子的發(fā)酵
        3.3.10 化合物的提取與HPLC-MS分析
    3.4 結(jié)果與分析
        3.4.1 基因簇的直接克隆與酶切鑒定
        3.4.2 用Redαβ同源重組技術(shù)添加結(jié)合轉(zhuǎn)移元件
        3.4.3 利用Redαβ同源重組技術(shù)添加啟動(dòng)子
        3.4.4 基因簇接合轉(zhuǎn)移到鏈霉菌中進(jìn)行的異源表達(dá)
        3.4.5 化合物的提取與HPLC-MS分析
    3.5 本章討論
        3.5.1 基因簇直接克隆和修飾
        3.5.2 Cluster 7基因簇異源表達(dá)產(chǎn)物的分離純化
第4章 ExoCET直接克隆技術(shù)的原理與應(yīng)用
    4.1 引言
    4.2 實(shí)驗(yàn)材料
        4.2.1 本研究所用菌株和質(zhì)粒
        4.2.2 分子生物學(xué)試劑
        4.2.3 寡核苷酸合成和DNA測序
    4.3 實(shí)驗(yàn)方法
        4.3.1 ExoCET直接克隆原理的探索
        4.3.2 基因簇的生物信息學(xué)分析
        4.3.3 基因組的提取與酶切
        4.3.4 大片段生物合成基因簇直接克隆載體的構(gòu)建
        4.3.5 大片段生物合成基因簇的直接克隆
        4.3.6 生物合成基因簇的修飾、發(fā)酵與分析
    4.4 結(jié)果與分析
        4.4.1 聯(lián)合體外退火和RecET重組促進(jìn)DNA的重組
        4.4.2 基因簇直接克隆載體的構(gòu)建
        4.4.3 細(xì)菌基因組的酶切
        4.4.4 生物合成基因簇的直接克隆
        4.4.5 基因簇添加結(jié)合轉(zhuǎn)移元件
        4.4.6 基因簇添加啟動(dòng)子
        4.4.7 提取轉(zhuǎn)化子的基因組進(jìn)行PCR檢測
    4.5 本章討論
        4.5.1 基因簇的直接克隆、修飾與異源表達(dá)
        4.5.2 ExoCET重組技術(shù)
第5章 聯(lián)合體外退火和RecET同源重組系統(tǒng)從頭合成基因簇
    5.1 引言
    5.2 實(shí)驗(yàn)材料
        5.2.1 本研究所用菌株和質(zhì)粒及其基因型和相關(guān)特征見表5-1
        5.2.2 分子生物學(xué)試劑
        5.2.3 寡核苷酸合成和DNA測序
    5.3 實(shí)驗(yàn)方法
        5.3.1 oligo重組模型的設(shè)計(jì)
        5.3.2 Oligo的體外處理
        5.3.3 Oligo重組線性載體的制備
        5.3.4 細(xì)胞感受態(tài)的制備
        5.3.5 菌落PCR鑒定oligo重組的片段大小
        5.3.6 DNA測序檢測oligo重組的片段序列是否正確
        5.3.7 利用ExoCET進(jìn)行DNA多片段的組裝
    5.4 結(jié)果與分析
        5.4.1 RecET重組酶誘導(dǎo)多個(gè)oligo重組
        5.4.2 RecET重組酶的拷貝數(shù)影響oligo重組的正確率
        5.4.3 兩步法合成Hemagglutinin基因(1683 bp)
        5.4.4 三步法合成PatellamideA基因簇(12,689 bp)
    5.5 本章討論
        5.5.1 RecET同源重組系統(tǒng)用于從頭合成基因簇
        5.5.2 影響Oligo重組的因素
第6章 研究結(jié)論與展望
    6.1 成功構(gòu)建了生物合成基因簇的直接克隆、修飾和異源表達(dá)的一體化工作平臺
    6.2 ExoCET重組技術(shù)極大提高了直接克隆大片段生物合成基因簇的效率
    6.3 聯(lián)合體外退火與RecET同源重組系統(tǒng)從頭合成基因簇
    6.4 未來的研究工作及展望
參考文獻(xiàn)
致謝
攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文和參加科研情況
附錄
學(xué)位論文評閱及答辯情況表



本文編號：3821779