目的:以大腸桿菌為底盤(pán)細(xì)胞,利用合成生物學(xué)手段導(dǎo)入外源雜合蒎烯合成代謝途徑,構(gòu)建高效合成蒎烯的微生物工廠(chǎng)。方法:將來(lái)源于酵母和糞腸球菌的異源雜合甲羥戊酸(MVA)代謝途徑和來(lái)源于北美巨冷杉的牻牛兒焦磷酸合酶(GPPS)和蒎烯合成酶(PS)基因序列共同導(dǎo)入大腸桿菌,構(gòu)建催化蒎烯合成的大腸桿菌工程菌。首先優(yōu)化合成GPPS、PS基因,再分別以pETDuet-1和pET-24a(+)載體為基礎(chǔ)構(gòu)建GPPS、PS共表達(dá)和融合表達(dá)載體,并分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌獲得工程菌E.hzh01和E.hzh02,搖瓶培養(yǎng)后利用GC-MS技術(shù)檢測(cè)E.hzh01和E.hzh02的蒎烯產(chǎn)量。進(jìn)一步獲取MVA代謝途徑相關(guān)酶基因mvaE、mvaS、ERG12、ERG8、ERG19、IDI序列,分別利用多順?lè)醋幽Ｐ秃虰ioBrick方法構(gòu)建2種不同方案的異源MVA代謝途徑,再將異源MVA代謝途徑和GPPS、PS融合表達(dá)基因共同轉(zhuǎn)化大腸桿菌,構(gòu)建完整蒎烯合成代謝工程菌株E.hzh03和E.hzh05。結(jié)果:搖瓶培養(yǎng)E.hzh01和E.hzh02的蒎烯產(chǎn)量分別為0.85和1.86 mg/L,結(jié)果表明融合表達(dá)更有利于蒎烯的合成。E....

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【文章目錄】：
1 材料與方法
    1.1 材料
    1.2 GPPS-PS表達(dá)載體的構(gòu)建
        1.2.1 目的基因的獲取
        1.2.2 構(gòu)建共表達(dá)載體
        1.2.3 構(gòu)建融合表達(dá)載體
        1.2.4 構(gòu)建共表達(dá)及融合表達(dá)工程菌
        1.2.5 蒎烯含量檢測(cè)
    1.3 含MVA途徑產(chǎn)蒎烯工程菌構(gòu)建
        1.3.1 構(gòu)建MVA上游表達(dá)載體
        1.3.2 多順?lè)醋幽Ｐ驮順?gòu)建MVA下游表達(dá)載體
        1.3.3 BioBrick原理構(gòu)建MVA下游表達(dá)載體
        1.3.4 含MVA代謝途徑產(chǎn)蒎烯工程菌的構(gòu)建
2 結(jié)果
    2.1 GPPS-PS表達(dá)載體的鑒定
    2.2 蒎烯含量檢測(cè)方法的建立
    2.3 目的蛋白融合表達(dá)可顯著提高蒎烯產(chǎn)量
    2.4 MVA上游表達(dá)載體p ACYCDuet-mva E/S的鑒定
    2.5 MVA下游表達(dá)載體pET24a-ERG12-8-19-IDI的鑒定
    2.6 工程菌產(chǎn)蒎烯能力檢測(cè)
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