磷脂具有良好的應(yīng)用前景,但天然磷脂結(jié)構(gòu)單一、含量低且種類較少。改性磷脂來(lái)源廣泛、種類多、功能性強(qiáng),成為近幾年關(guān)注的焦點(diǎn)。酶改性則是一種高效溫和的磷脂改性方法,其中磷脂酶D是一類特殊的酯鍵水解酶,在一定的條件下,它能水解磷脂生成磷脂酸和羥基化合物,并能催化某些含羥基的化合物結(jié)合到磷脂的�；�,生成許多稀有磷脂和半合成磷脂,滿足食品和醫(yī)藥等領(lǐng)域的需要。磷脂酶D廣泛存在于微生物、植物、動(dòng)物中,特別是來(lái)源于微生物的磷脂酶D,表現(xiàn)出很好的轉(zhuǎn)酯能力和水解能力。實(shí)驗(yàn)室從土壤中篩選菌株,通過(guò)菌落水解圈法對(duì)菌種進(jìn)行自然選育,并搖瓶復(fù)篩得到一株產(chǎn)磷脂酶D的菌株P(guān)1,目的菌株P(guān)1是革蘭氏陽(yáng)性、兼性厭氧、芽孢邊端生的棒狀桿菌。菌體長(zhǎng)1.8-2.4μm,寬0.8-1.0μm;菌落呈黃白色,表面粗糙,中間隆起,邊緣整齊。通過(guò)16S rRNA序列比對(duì)分析,該菌株與Bacillus cereus相似度為99.73%。最適生長(zhǎng)條件:溫度30℃,pH 6.0-7.0,不耐鹽;其他各項(xiàng)生理生化鑒定結(jié)果與模式菌株基本一致;主要磷脂組分為磷脂酰乙醇胺PE和磷脂酰膽堿PC;G+C含量為42.01 mol%。菌株P(guān)1屬于芽孢桿菌屬...

【文章頁(yè)數(shù)】：66 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
abstract
第一章 文獻(xiàn)綜述
    1.1 磷脂
        1.1.1 磷脂的來(lái)源組成及結(jié)構(gòu)
        1.1.2 磷脂的性質(zhì)
        1.1.3 磷脂功能
        1.1.4 磷脂改性
        1.1.5 磷脂的應(yīng)用
    1.2 磷脂酶D
        1.2.1 磷脂酶
        1.2.2 磷脂酶D的概況
            1.2.2.1 磷脂酶D的來(lái)源
            1.2.2.2 磷脂酶D的生理功能
            1.2.2.3 磷脂酶D的催化反應(yīng)機(jī)理
            1.2.2.4 磷脂酶D的反應(yīng)影響因素
        1.2.3 磷脂酶D的應(yīng)用
    1.3 本論文研究?jī)?nèi)容
第二章 磷脂酶D產(chǎn)生菌的篩選與鑒定
    2.1 材料與試劑
    2.2 儀器設(shè)備
    2.3 培養(yǎng)基
        2.3.1 生長(zhǎng)培養(yǎng)基
        2.3.2 分類鑒定培養(yǎng)基
        2.3.3 標(biāo)準(zhǔn)菌株
    2.4 實(shí)驗(yàn)方法
        2.4.1 磷脂酶D產(chǎn)生菌的篩選
            2.4.1.1 磷脂酶D產(chǎn)生菌的初篩
            2.4.1.2 磷脂酶D產(chǎn)生菌的復(fù)篩
        2.4.2 培養(yǎng)特征分析
        2.4.3 形態(tài)特征分析
            2.4.3.1 革蘭氏染色
            2.4.3.2 芽孢染色
            2.4.3.3 掃描電鏡實(shí)驗(yàn)(SEM)
        2.4.4 16SrRNA的序列分析
        2.4.5 生理生化特征鑒定
            2.4.5.1 生長(zhǎng)曲線
            2.4.5.2 生長(zhǎng)溫度范圍
            2.4.5.3 生長(zhǎng)pH范圍
            2.4.5.4 耐鹽度
            2.4.5.5 運(yùn)動(dòng)性實(shí)驗(yàn)
            2.4.5.6 需氧性試驗(yàn)
            2.4.5.7 石蕊牛奶實(shí)驗(yàn)
            2.4.5.8 酪素水解實(shí)驗(yàn)
            2.4.5.9 馬尿酸鹽水解實(shí)驗(yàn)
            2.4.5.10 卵磷脂酶實(shí)驗(yàn)
            2.4.5.11 過(guò)氧化氫酶(接觸酶)實(shí)驗(yàn)
            2.4.5.12 明膠液化
            2.4.5.13 淀粉水解反應(yīng)
            2.4.5.14 硝酸鹽還原實(shí)驗(yàn)
            2.4.5.15 抗生素敏感實(shí)驗(yàn)
        2.4.6 化學(xué)特征分析-磷酸類脂分析
            2.4.6.1 菌體收集
            2.4.6.2 磷酸類脂的提取
            2.4.6.3 磷酸類脂顯色劑配置
            2.4.6.4 點(diǎn)樣與層析
            2.4.6.5 薄板顯色
        2.4.7 分子特征分析-DNA(G+C)mol%含量分析
            2.4.7.1 DNA提取
            2.4.7.2 DNA的純化
            2.4.7.3 DNA的純度檢測(cè)
            2.4.7.4 DNA的酶解
            2.4.7.5 G+C含量的測(cè)定
    2.5 結(jié)果與討論
        2.5.1 磷脂酶D產(chǎn)生菌的篩選及培養(yǎng)特征分析
        2.5.2 形態(tài)特征分析
            2.5.2.1 革蘭氏染色
            2.5.2.2 芽孢染色
            2.5.2.3 掃描電鏡(SEM)
        2.5.3 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建
        2.5.4 生理生化特征鑒定
            2.5.4.1 生長(zhǎng)曲線
            2.5.4.2 生長(zhǎng)溫度范圍
            2.5.4.3 生長(zhǎng)PH范圍
            2.5.4.4 耐鹽度
            2.5.4.5 生理生化特征實(shí)驗(yàn)結(jié)果
            2.5.4.6 抗生素敏感性
            2.5.4.7 化學(xué)特征分析-磷酸類脂分析結(jié)果
            2.5.4.8 基因特征——DNA(G+C)mol%含量分析
    2.6 本章小結(jié)
第三章 磷脂酶D活性檢測(cè)方法的建立
    3.1 材料與試劑
    3.2 實(shí)驗(yàn)方法
        3.2.1 試劑配制
        3.2.2 粗酶液的制備
        3.2.3 最佳吸收波長(zhǎng)的選擇
        3.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
        3.2.5 酶活的測(cè)定
        3.2.6 發(fā)酵液用量的選擇
        3.2.7 酶反應(yīng)時(shí)間的選擇
        3.2.8 雷氏鹽用量的選擇
        3.2.9 與雷氏鹽反應(yīng)時(shí)間的選擇
        3.2.10 蛋白沉淀量對(duì)膽堿雷氏鹽生成的影響
    3.3 結(jié)果與討論
        3.3.1 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇
        3.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制和檢出限
        3.3.3 發(fā)酵液用量的選擇
        3.3.4 酶反應(yīng)時(shí)間的選擇
        3.3.5 雷氏鹽用量的選擇
        3.3.6 與雷氏鹽反應(yīng)時(shí)間的選擇
        3.3.7 蛋白沉淀量對(duì)膽堿雷氏鹽生成的影響
    3.4 本章小結(jié)
第四章 磷脂酶D基因表達(dá)載體的構(gòu)建
    4.1 實(shí)驗(yàn)材料
        4.1.1 實(shí)驗(yàn)試劑
        4.1.2 實(shí)驗(yàn)菌株及質(zhì)粒
        4.1.3 PCR引物
        4.1.4 培養(yǎng)基
        4.1.5 實(shí)驗(yàn)試劑
    4.2 實(shí)驗(yàn)方法
        4.2.1 目的基因擴(kuò)增及驗(yàn)證
            4.2.1.1 目的基因擴(kuò)增
            4.2.1.2 瓊脂糖凝膠電泳及膠回收
        4.2.2 克隆質(zhì)粒的構(gòu)建
            4.2.2.1 感受態(tài)細(xì)胞的制備
            4.2.2.2 質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化方法
        4.2.3 PCR克隆檢測(cè)及酶切驗(yàn)證
            4.2.3.1 PCR克隆檢測(cè)
            4.2.3.2 質(zhì)粒的提取(堿裂解法)
            4.2.3.3 酶切體系
        4.2.4 表達(dá)載體構(gòu)建
            4.2.4.1 大腸桿菌表達(dá)宿主rosetta超級(jí)感受態(tài)的制備
            4.2.4.2 雙酶切體系
            4.2.4.3 連接體系
    4.3 結(jié)果與討論
        4.3.1 磷脂酶D基因的篩選與克隆
        4.3.2 磷脂酶D基因的表達(dá)載體的構(gòu)建
    4.4 本章小結(jié)
結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝



本文編號(hào)：3807373