地黃(Rehmannia glutinosa Libosch)是玄參科地黃屬多年生草本植物,因具有重要的藥用價值和食用價值而被廣泛應(yīng)用,在我國有著悠久的用藥歷史。地黃含有梓醇、毛蕊花糖苷、地黃素和糖類等化學(xué)成分。其中,毛蕊花糖苷作為地黃的指標(biāo)成分之一,具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、神經(jīng)保護和增強記憶力等多種生理活性。由于毛蕊花糖苷在植物界分布廣、毒副作用小和生物活性強而備受研究者青睞,成為了藥物開發(fā)的新目標(biāo)。目前,毛蕊花糖苷主要來源于藥用植物的提取。但是,藥用植物成分復(fù)雜,提取分離難度很大,嚴(yán)重妨礙了對其的開發(fā)和利用;并且人類過度采挖和種植植物的土地面積的減少,用于提取毛蕊花糖苷的植物資源越來越匱乏。因此,毛蕊花糖苷生物合成途徑及其相關(guān)酶基因的研究作為開發(fā)毛蕊花糖苷的一條重要途徑受到人們重視,而且推測出部分毛蕊花糖苷生物合成途徑,發(fā)現(xiàn)了少量其上游合成酶基因。但是,目前,尚未見其真正的生物合成途徑報道,有更多合成基因有待發(fā)掘。本研究以地黃塊根為材料,采用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)挖掘其毛蕊花糖苷生物合成相關(guān)酶基因,建立其生物合成途徑;采用RT-PCR技術(shù)驗證其關(guān)鍵酶基因的存在;采用qRT-PCR技術(shù)鑒定...

【文章頁數(shù)】：82 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
縮略語表
1 前言
    1.1 地黃概述
        1.1.1 地黃的藥用和保健作用
        1.1.2 地黃化學(xué)成分研究
    1.2 毛蕊花糖苷概述
        1.2.1 毛蕊花糖苷的藥理作用
        1.2.2 毛蕊花糖苷生物合成途徑研究
        1.2.3 毛蕊花糖苷生物合成相關(guān)酶基因研究
    1.3 轉(zhuǎn)錄組及其在藥用植物研究中的應(yīng)用
        1.3.1 轉(zhuǎn)錄組測序及其研究進(jìn)展
        1.3.2 轉(zhuǎn)錄組測序在藥用植物方面的應(yīng)用
        1.3.3 轉(zhuǎn)錄組測序在地黃研究中的應(yīng)用
    1.4 本課題研究目的及意義
2 材料與方法
    2.1 材料
        2.1.1 植物材料
        2.1.2 菌株和載體
        2.1.3 引物
        2.1.4 實驗儀器設(shè)備
        2.1.5 實驗試劑及藥品
        2.1.6 主要試劑配方
    2.2 轉(zhuǎn)錄組測序方法
        2.2.1 RNA的提取和質(zhì)檢
        2.2.2 轉(zhuǎn)錄組文庫的構(gòu)建、質(zhì)檢
        2.2.3 測序數(shù)據(jù)分析
    2.3 毛蕊花糖苷生物合成途徑的建立
    2.4 候選基因RT-PCR及同源比對分析
    2.5 候選基因熒光定量PCR
        2.5.1 總RNA的提取與檢測
        2.5.2 cDNA的合成
        2.5.3 熒光定量PCR內(nèi)參基因的選擇
        2.5.4 熒光定量PCR反應(yīng)
    2.6 毛蕊花糖苷生物合成途徑關(guān)鍵酶RgC4H的克隆和表達(dá)載體構(gòu)建
        2.6.1 RgC4H基因克隆及蛋白分析
        2.6.2 RgC4H基因植物表達(dá)載體的構(gòu)建
3 結(jié)果與分析
    3.1 轉(zhuǎn)錄組測序
        3.1.1 RNA的提取和質(zhì)檢
        3.1.2 轉(zhuǎn)錄組文庫的構(gòu)建、質(zhì)檢
        3.1.3 原始數(shù)據(jù)的統(tǒng)計
        3.1.4 轉(zhuǎn)錄本的組裝
        3.1.5 基因功能的注釋及分類
    3.2 毛蕊花糖苷生物合成途徑的建立
    3.3 毛蕊花糖苷生物合成候選關(guān)鍵酶基因的挖掘
    3.4 毛蕊花糖苷生物合成候選關(guān)鍵酶基因的驗證
        3.4.1 毛蕊花糖苷生物合成候選關(guān)鍵酶基因的RT-PCR
        3.4.2 毛蕊花糖苷生物合成候選關(guān)鍵酶基因的序列分析
    3.5 毛花糖苷生物合成候選關(guān)鍵酶基因的鑒定
        3.5.1 總RNA的提取與檢測
        3.5.2 毛花糖苷生物合成候選關(guān)鍵酶基因的空間特異性表達(dá)
        3.5.3 毛花糖苷生物合成候選關(guān)鍵酶基因的時間和基因型特異性表達(dá)
        3.5.4 毛花糖苷生物合成途徑RgC4H基因的克隆和表達(dá)載體構(gòu)建
4 討論
    4.1 轉(zhuǎn)錄組測序及功能注釋結(jié)果評價
    4.2 毛蕊花糖苷生物合成途徑構(gòu)建及相關(guān)酶基因的發(fā)掘與驗證
    4.3 毛蕊花糖苷生物合成途徑中關(guān)鍵酶基因的鑒定
5 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝
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本文編號：3801966