在益生菌的選育、體內(nèi)效價(jià)評(píng)定以及作用機(jī)制研究中,建立腸道攻毒模型可以提供一種有效的手段,即采用特定的病原菌,建立其特異性標(biāo)記和檢測(cè)方法,用于體內(nèi)示蹤和分布的研究。常規(guī)的模型以綠色熒光蛋白標(biāo)記及特異性檢測(cè)居多,但存在菌株遺傳穩(wěn)定性差、檢測(cè)特異性不強(qiáng)等問(wèn)題,尤其受到體內(nèi)背景熒光干擾大的影響,測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確性不高。本研究以腸毒性大腸桿菌作為通用病原菌,采用紅色熒光蛋白標(biāo)記的方法,嘗試應(yīng)用不同的分子標(biāo)記模式,擬構(gòu)建出熒光表達(dá)穩(wěn)定、特異性更強(qiáng)的熒光標(biāo)記菌株,為進(jìn)一步建立病原菌的攻毒模型奠定菌株和方法學(xué)基礎(chǔ)。具體研究?jī)?nèi)容和相關(guān)結(jié)果如下:(1)選擇紅色熒光蛋白mKate和mCherry作為報(bào)告基因,分別連入3種常見表達(dá)載體pET-28a、pET-9a和pQE30,得到6種重組質(zhì)粒并分別轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞TOP10中。在無(wú)誘導(dǎo)劑的條件下,成功篩選得到兩種重組質(zhì)粒pQE30-mKate,pQE30-mCherry,其轉(zhuǎn)化菌株菌落呈現(xiàn)明顯紅色。以這兩種重組質(zhì)粒為基礎(chǔ),進(jìn)一步分別化轉(zhuǎn)到不同類型的腸毒性大腸桿菌細(xì)胞(E.coli K88ab、E.coli K88ac、E.coli K99和E.coli 987P)...

【文章頁(yè)數(shù)】：106 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 緒論
    1.1 產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌的研究概況
    1.2 ETEC的毒力因子及致病機(jī)制
        1.2.1 黏附素
        1.2.2 腸毒素
    1.3 ETEC的防治措施
    1.4 熒光標(biāo)記技術(shù)
        1.4.1 熒光蛋白的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)
        1.4.2 熒光蛋白的標(biāo)記方式
        1.4.3 熒光蛋白的應(yīng)用
    1.5 攻毒模型的研究現(xiàn)狀
    1.6 研究意義及內(nèi)容
        1.6.1 研究意義
        1.6.2 研究技術(shù)路線
        1.6.3 研究?jī)?nèi)容
第二章 RFP表達(dá)載體的構(gòu)建及ETEC表達(dá)宿主的篩選
    2.1 前言
    2.2 試驗(yàn)材料
        2.2.1 菌株和載體
        2.2.2 培養(yǎng)基、工具酶和試劑
        2.2.3 儀器與設(shè)備
    2.3 試驗(yàn)方法
        2.3.1 基于RFP基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建
        2.3.2 RFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主ETEC及陽(yáng)性克隆的篩選
    2.4 結(jié)果與分析
        2.4.1 紅色熒光蛋白mKate和 mCherry的 PCR擴(kuò)增結(jié)果
        2.4.2 重組質(zhì)粒菌落PCR鑒定
        2.4.3 重組質(zhì)粒雙酶切鑒定
        2.4.4 重組質(zhì)粒在工程菌及ETEC中的表達(dá)
        2.4.5 重組菌E.coli K88ab/K99-mKate/mCherry的 PCR驗(yàn)證
        2.4.6 重組菌E.coli K88ab/K99-mKate/mCherry熒光顯微鏡觀察
        2.4.7 重組菌E.coli K88ab/K99-mKate/mCherry熒光強(qiáng)度的測(cè)定
        2.4.8 重組菌E.coli K99-mCherry的分子鑒定
        2.4.9 重組菌E.coli K99-mCherry和菌株E.coli K99 生長(zhǎng)曲線比較
        2.4.10 重組菌E.coli K99-mCherry中 mCherry基因表達(dá)穩(wěn)定性測(cè)定
        2.4.11 熒光體系下E.coli K99-mCherry活菌濃度檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立
    2.5 討論
    2.6 小結(jié)
第三章 基因劑量對(duì)RFP標(biāo)記ETEC的影響
    3.1 前言
    3.2 試驗(yàn)材料
        3.2.1 菌株和載體
        3.2.2 培養(yǎng)基、工具酶和試劑
        3.2.3 儀器與設(shè)備
    3.3 試驗(yàn)方法
        3.3.1 多拷貝紅色熒光蛋白mCherry重組質(zhì)粒的構(gòu)建
        3.3.2 多拷貝重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化E.coli K99 及熒光強(qiáng)度的測(cè)定
    3.4 結(jié)果與分析
        3.4.1 雙拷貝重組質(zhì)粒酶切鑒定
        3.4.2 多拷貝菌株的熒光強(qiáng)度測(cè)定與比較
    3.5 討論
    3.6 小結(jié)
第四章 基于表面展示系統(tǒng)的ETEC-RFP特異性標(biāo)記
    4.1 前言
    4.2 試驗(yàn)材料
        4.2.1 菌株和載體
        4.2.2 培養(yǎng)基、工具酶和試劑
        4.2.3 儀器與設(shè)備
    4.3 試驗(yàn)方法
        4.3.1 大腸桿菌表面展示表達(dá)載體的構(gòu)建
        4.3.2 E.coli K99 表面展示融合蛋白Lpp’OmpA-mCherry
    4.4 結(jié)果和分析
        4.4.1 PCR擴(kuò)增結(jié)果
        4.4.2 重組質(zhì)粒pLpp’OmpA雙酶切鑒定
        4.4.3 重組質(zhì)粒pLpp’OmpA-mCherry雙酶切鑒定
        4.4.4 重組菌的雙酶切鑒定
        4.4.5 重組菌E.coli K99-Lpp’OmpA-mCherry的分子鑒定
        4.4.6 重組菌E.coli K99-Lpp’OmpA-mCherry熒光顯微鏡觀察
        4.4.7 E.coli K99 表面展示mCherry的生物活性檢測(cè)
        4.4.8 E.coli K99 表面展示mCherry的表達(dá)穩(wěn)定性檢測(cè)
        4.4.9 熒光體系下E.coli K99-Lpp’OmpA-mCherry活菌濃度檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立
    4.5 討論
    4.6 小結(jié)
第五章 基于CRISPR/Cas9 系統(tǒng)介導(dǎo)的ETEC-RFP特異性標(biāo)記
    5.1 前言
    5.2 試驗(yàn)材料
        5.2.1 菌株和載體
        5.2.2 培養(yǎng)基、工具酶和試劑
        5.2.3 儀器與設(shè)備
    5.3 試驗(yàn)方法
        5.3.1 質(zhì)粒DNA的制備
        5.3.2 大腸桿菌K12和K99 的基因組DNA的制備
        5.3.3 大腸桿菌K99和DH5α感受態(tài)細(xì)胞的制備
        5.3.4 基因敲入位點(diǎn)的選擇
        5.3.5 sgRNA的設(shè)計(jì)及基因編輯載體的構(gòu)建
        5.3.6 基因編輯菌株的篩選及基因編輯載體的去除
        5.3.7 基因編輯菌株的熒光檢測(cè)
        5.3.8 基因編輯菌株分子背景鑒定
        5.3.9 誘導(dǎo)劑對(duì)基因編輯菌株紅色熒光蛋白表達(dá)的影響
        5.3.10 基因編輯菌株生長(zhǎng)特性曲線測(cè)定
        5.3.11 基因編輯菌株穩(wěn)定性的測(cè)定
        5.3.12 熒光體系下基因編輯菌株活菌濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立
    5.4 結(jié)果與分析
        5.4.1 假基因位點(diǎn)的選擇和驗(yàn)證
        5.4.2 mCherry基因編輯菌株的構(gòu)建及鑒定
        5.4.3 基因編輯質(zhì)粒的去除
        5.4.4 基因編輯菌株熒光顯微鏡觀察
        5.4.5 基因編輯菌株的分子鑒定
        5.4.6 不同誘導(dǎo)劑及其濃度對(duì)熒光蛋白表達(dá)量的影響
        5.4.7 基因編輯菌株的生物活性檢測(cè)
        5.4.8 基因編輯菌株中mCherry的表達(dá)穩(wěn)定性檢測(cè)
        5.4.9 熒光體系下基因編輯菌株活菌濃度檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立
    5.5 討論
    5.6 小結(jié)
第六章 ETEC-RFP標(biāo)記菌株的綜合評(píng)價(jià)及其在大鼠胃腸道樣品中特異性熒光檢測(cè)
    6.1 前言
    6.2 試驗(yàn)材料
        6.2.1 菌株和試劑
        6.2.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
        6.2.3 儀器與設(shè)備
    6.3 試驗(yàn)方法
        6.3.1 不同標(biāo)記方法中mCherry基因表達(dá)穩(wěn)定性的比較
        6.3.2 胃腸道內(nèi)容物樣品處理方法
        6.3.3 胃腸道內(nèi)容物的熒光特異性檢測(cè)
        6.3.4 統(tǒng)計(jì)分析
    6.4 結(jié)果與分析
        6.4.1 標(biāo)記菌株mCherry基因表達(dá)穩(wěn)定性的比較
        6.4.2 大鼠不同胃腸段內(nèi)容物對(duì)熒光檢測(cè)的干擾
    6.5 討論
    6.6 小結(jié)
結(jié)論
參考文獻(xiàn)
附錄A 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的論文
附錄B 基因編輯的序列
致謝



本文編號(hào)：3799267