發(fā)布時間：2023-04-22 21:21

　　嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)是一種典型的人-獸-魚共患病病原菌,該菌釋放毒力因子的過程受群體感應(quorum sensing,QS)系統(tǒng)的調控,嗜水氣單胞菌中存在著以�；呓z氨酸內酯(AHL)為信號分子的感應通路和以呋喃酰硼酸二酯(AI-2)為信號分子的感應通路。已有文獻報道,嗜水氣單胞菌中群體感應調控因子AhyRI和LuxS對LitR具有調控作用,并且LitR與已報道的7個致病菌中群體感應調控因子保守序列高度相似,因此我們推測LitR是嗜水氣單胞菌群體感應雙通路的響應因子,有可能作為群體感應調控因子發(fā)揮作用。本文通過研究LitR表達與細菌濃度關系、litR基因缺失對毒力基因轉錄表達的影響、LitR與毒力基因的體外結合,旨在探究嗜水氣單胞菌中LitR蛋白對毒力基因的調控機理。首先,構建用于LitR異源表達的重組菌Escherichia coli BL21(DE3)-pET28a-litR,IPTG誘導LitR蛋白表達,進而利用親和層析和凝膠過濾層析純化技術對LitR蛋白進行純化,用純化后的LitR蛋白制備多克隆抗體,以Gap-2為內參蛋白,利用wester...

【文章頁數(shù)】：77 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
abstract
第一章 緒論
    1.1 嗜水氣單胞菌的研究近況
        1.1.1 嗜水氣單胞菌簡介
        1.1.2 嗜水氣單胞菌群體感應系統(tǒng)
    1.2 響應因子LitR
    1.3 嗜水氣單胞菌毒力因子
        1.3.1 溶血素
        1.3.2 胞外蛋白酶
        1.3.3 絲氨酸蛋白酶
        1.3.4 T6SS效應蛋白
    1.4 選題意義與研究內容
第二章 LitR表達與細菌濃度關系研究
    2.1 實驗材料
        2.1.1 菌株及質粒
        2.1.2 主要試劑及規(guī)格
        2.1.3 主要培養(yǎng)基及溶液配制
        2.1.4 主要儀器
    2.2 實驗方法
        2.2.1 LitR蛋白的表達與純化
            2.2.1.1 重組菌E.coli(BL21)-pET28a-litR的構建
            2.2.1.2 LitR蛋白的誘導表達
            2.2.1.3 LitR蛋白的純化
            2.2.1.4 LitR蛋白聚合形式分析
        2.2.2 LitR抗體的制備及檢測
            2.2.2.1 LitR抗體的制備
            2.2.2.2 LitR抗體的檢測
        2.2.3 LitR表達的研究
            2.2.3.1 內參抗體Gap-2 的制備及檢測
            2.2.3.2 LitR表達與細菌濃度關系研究
    2.3 結果與討論
        2.3.1 LitR蛋白的表達與純化
        2.3.2 LitR抗體的制備及檢測
        2.3.3 LitR表達與菌體濃度的研究
第三章 lit R基因缺失突變株的構建及其特性研究
    3.1 實驗材料
        3.1.1 菌株及質粒
        3.1.2 主要試劑及規(guī)格
        3.1.3 主要培養(yǎng)基及溶液配制
        3.1.4 主要儀器
    3.2 實驗方法
        3.2.1 litR基因缺失突變株的構建
            3.2.1.1 PCR引物設計及合成
            3.2.1.2 litR基因上下游同源臂及氯霉素基因片段的獲取
            3.2.1.3 litR基因缺失片段的獲得
            3.2.1.4 重組菌E.coli SM10(λpir)-pWM91-ΔlitR的構建
            3.2.1.5 litR基因缺失突變株的篩選及鑒定
        3.2.2 litR基因缺失突變株的特性研究
            3.2.2.1 缺失突變株與野生株生長曲線的測定
            3.2.2.2 LitR對毒力基因調控的研究
    3.3 結果與討論
        3.3.1 litR基因缺失突變株的構建
        3.3.2 litR基因缺失突變株的特性研究
            3.3.2.1 缺失突變株與野生株生長曲線的測定
            3.3.2.2 LitR對毒力基因調控的研究
第四章 LitR與毒力基因體外結合研究
    4.1 實驗材料
        4.1.1 菌株及質粒
        4.1.2 主要試劑及規(guī)格
        4.1.3 主要培養(yǎng)基及溶液配制
        4.1.4 主要儀器
    4.2 實驗方法
        4.2.1 LitR與毒力基因體外結合的研究
            4.2.1.1 探針制備
            4.2.1.2 EMSA實驗
        4.2.2 LitR與毒力基因結合位點的研究
            4.2.2.1 探針制備
            4.2.2.2 DNase I footprinting反應
    4.3 結果與討論
        4.3.1 LitR與毒力基因體外結合的研究
        4.3.2 LitR與毒力基因結合位點的研究
結論與展望
參考文獻
致謝
附錄
    附錄A 重組自殺質粒pWM91-ΔlitR構建示意圖
    附錄B 嗜水氣單胞菌litR基因缺失突變株基因測序序列
    附錄C 研究生期間發(fā)表的學術論文



本文編號：3798416