嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)是一種典型的人-獸-魚共患病病原菌,該菌釋放毒力因子的過程受群體感應(yīng)(quorum sensing,QS)系統(tǒng)的調(diào)控,嗜水氣單胞菌中存在著以�；呓z氨酸內(nèi)酯(AHL)為信號分子的感應(yīng)通路和以呋喃酰硼酸二酯(AI-2)為信號分子的感應(yīng)通路。已有文獻(xiàn)報(bào)道,嗜水氣單胞菌中群體感應(yīng)調(diào)控因子AhyRI和LuxS對LitR具有調(diào)控作用,并且LitR與已報(bào)道的7個(gè)致病菌中群體感應(yīng)調(diào)控因子保守序列高度相似,因此我們推測LitR是嗜水氣單胞菌群體感應(yīng)雙通路的響應(yīng)因子,有可能作為群體感應(yīng)調(diào)控因子發(fā)揮作用。本文通過研究LitR表達(dá)與細(xì)菌濃度關(guān)系、litR基因缺失對毒力基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的影響、LitR與毒力基因的體外結(jié)合,旨在探究嗜水氣單胞菌中LitR蛋白對毒力基因的調(diào)控機(jī)理。首先,構(gòu)建用于LitR異源表達(dá)的重組菌Escherichia coli BL21(DE3)-pET28a-litR,IPTG誘導(dǎo)LitR蛋白表達(dá),進(jìn)而利用親和層析和凝膠過濾層析純化技術(shù)對LitR蛋白進(jìn)行純化,用純化后的LitR蛋白制備多克隆抗體,以Gap-2為內(nèi)參蛋白,利用wester...

【文章頁數(shù)】：77 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
abstract
第一章 緒論
    1.1 嗜水氣單胞菌的研究近況
        1.1.1 嗜水氣單胞菌簡介
        1.1.2 嗜水氣單胞菌群體感應(yīng)系統(tǒng)
    1.2 響應(yīng)因子LitR
    1.3 嗜水氣單胞菌毒力因子
        1.3.1 溶血素
        1.3.2 胞外蛋白酶
        1.3.3 絲氨酸蛋白酶
        1.3.4 T6SS效應(yīng)蛋白
    1.4 選題意義與研究內(nèi)容
第二章 LitR表達(dá)與細(xì)菌濃度關(guān)系研究
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.1 菌株及質(zhì)粒
        2.1.2 主要試劑及規(guī)格
        2.1.3 主要培養(yǎng)基及溶液配制
        2.1.4 主要儀器
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 LitR蛋白的表達(dá)與純化
            2.2.1.1 重組菌E.coli(BL21)-pET28a-litR的構(gòu)建
            2.2.1.2 LitR蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)
            2.2.1.3 LitR蛋白的純化
            2.2.1.4 LitR蛋白聚合形式分析
        2.2.2 LitR抗體的制備及檢測
            2.2.2.1 LitR抗體的制備
            2.2.2.2 LitR抗體的檢測
        2.2.3 LitR表達(dá)的研究
            2.2.3.1 內(nèi)參抗體Gap-2 的制備及檢測
            2.2.3.2 LitR表達(dá)與細(xì)菌濃度關(guān)系研究
    2.3 結(jié)果與討論
        2.3.1 LitR蛋白的表達(dá)與純化
        2.3.2 LitR抗體的制備及檢測
        2.3.3 LitR表達(dá)與菌體濃度的研究
第三章 lit R基因缺失突變株的構(gòu)建及其特性研究
    3.1 實(shí)驗(yàn)材料
        3.1.1 菌株及質(zhì)粒
        3.1.2 主要試劑及規(guī)格
        3.1.3 主要培養(yǎng)基及溶液配制
        3.1.4 主要儀器
    3.2 實(shí)驗(yàn)方法
        3.2.1 litR基因缺失突變株的構(gòu)建
            3.2.1.1 PCR引物設(shè)計(jì)及合成
            3.2.1.2 litR基因上下游同源臂及氯霉素基因片段的獲取
            3.2.1.3 litR基因缺失片段的獲得
            3.2.1.4 重組菌E.coli SM10(λpir)-pWM91-ΔlitR的構(gòu)建
            3.2.1.5 litR基因缺失突變株的篩選及鑒定
        3.2.2 litR基因缺失突變株的特性研究
            3.2.2.1 缺失突變株與野生株生長曲線的測定
            3.2.2.2 LitR對毒力基因調(diào)控的研究
    3.3 結(jié)果與討論
        3.3.1 litR基因缺失突變株的構(gòu)建
        3.3.2 litR基因缺失突變株的特性研究
            3.3.2.1 缺失突變株與野生株生長曲線的測定
            3.3.2.2 LitR對毒力基因調(diào)控的研究
第四章 LitR與毒力基因體外結(jié)合研究
    4.1 實(shí)驗(yàn)材料
        4.1.1 菌株及質(zhì)粒
        4.1.2 主要試劑及規(guī)格
        4.1.3 主要培養(yǎng)基及溶液配制
        4.1.4 主要儀器
    4.2 實(shí)驗(yàn)方法
        4.2.1 LitR與毒力基因體外結(jié)合的研究
            4.2.1.1 探針制備
            4.2.1.2 EMSA實(shí)驗(yàn)
        4.2.2 LitR與毒力基因結(jié)合位點(diǎn)的研究
            4.2.2.1 探針制備
            4.2.2.2 DNase I footprinting反應(yīng)
    4.3 結(jié)果與討論
        4.3.1 LitR與毒力基因體外結(jié)合的研究
        4.3.2 LitR與毒力基因結(jié)合位點(diǎn)的研究
結(jié)論與展望
參考文獻(xiàn)
致謝
附錄
    附錄A 重組自殺質(zhì)粒pWM91-ΔlitR構(gòu)建示意圖
    附錄B 嗜水氣單胞菌litR基因缺失突變株基因測序序列
    附錄C 研究生期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文



本文編號：3798416