本文關(guān)鍵詞：玉米轉(zhuǎn)錄因子基因ZmEREB87的克隆及功能分析，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：玉米(Zea mays L.)是在世界范圍內(nèi)分布最廣泛的糧食作物之一,也是非常重要的經(jīng)濟(jì)作物、家畜飼料和工業(yè)原料。在我國(guó),玉米的播種面積已然超過小麥與水稻,成為第一大糧食作物。然而,干旱、低溫、高鹽、水澇、病害等環(huán)境因子嚴(yán)重影響玉米的生長(zhǎng)發(fā)育,是造成玉米減產(chǎn)的主要原因。隨著科學(xué)家們對(duì)分子生物學(xué)及功能基因組學(xué)研究的深入,挖掘關(guān)鍵抗逆基因資源,并采用基因工程或分子標(biāo)記技術(shù)培育抗逆作物新品種已成為作物育種工作的主要方向。根據(jù)強(qiáng)抗旱型玉米自交系F83的干旱轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果,選取受干旱誘導(dǎo)明顯上調(diào)表達(dá)的AP2/EREBP轉(zhuǎn)錄因子家族成員Zm EREB87作為研究對(duì)象,采用RTPCR方法從F83中克隆了該基因的CDS區(qū),通過生物信息方法分析了該基因的基本結(jié)構(gòu)特征及分子進(jìn)化關(guān)系,采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time quantitative PCR,q RT-PCR)方法研究了該基因的組織特異性及在不同非生物脅迫下的誘導(dǎo)表達(dá)模式,通過構(gòu)建Zm EREB87基因的植物過表達(dá)載體,采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法分別轉(zhuǎn)化擬南芥及煙草,對(duì)過表達(dá)株系的抗旱功能進(jìn)行了初步分析,取得如下結(jié)果:1.根據(jù)玉米轉(zhuǎn)錄因子基因Zm EREB87的m RNA序列,設(shè)計(jì)特異性引物,采用RT-PCR方法從F83中克隆了該基因的CDS區(qū),生物信息學(xué)分析表明,該基因編碼315個(gè)氨基酸殘基,理論分子量為33.8 KDa,理論等電點(diǎn)為5.25;不穩(wěn)定系數(shù)為63.03,屬于不穩(wěn)定蛋白;保守結(jié)構(gòu)域分析表明該基因編碼蛋白屬于EREBP亞家族的轉(zhuǎn)錄因子成員;進(jìn)化分析表明,Zm EREB87蛋白與高粱的Sb EREBP蛋白親緣關(guān)系較近,與擬南芥At ERF07蛋白及葡萄Vv EREBP蛋白親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。2.采用q RT-PCR方法分析了Zm EREB87基因的組織特異性及其在6種非生物脅迫下的誘導(dǎo)表達(dá)模式,結(jié)果表明Zm EREB87基因在幼芽中表達(dá)量最高;玉米葉片中Zm EREB87基因在ABA(100μM)、干旱脫水、高鹽(250 m M Na Cl)、20%PEG、高溫(42℃)脅迫中上調(diào)表達(dá),在低溫(4℃)脅迫中下調(diào)表達(dá)。表明Zm EREB87基因可能是通過ABA依賴的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑參與玉米應(yīng)答非生物脅迫的過程。3.以p CAMBIA3300為基礎(chǔ)載體,采用分步酶切和連接的方法,構(gòu)建了含有1個(gè)Kpn I位點(diǎn)的載體p CAMBIA3300-K,然后通過構(gòu)建中間載體p CAMBIA3300-K-EREB87從而構(gòu)建了含有Zm EREB87基因的目的片段的植物表達(dá)載體p CAMBI A3300-35S-EREB87-NOS。采用凍融法轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌LBA4404,通過農(nóng)桿菌葉盤法和花序浸染法分別對(duì)煙草和擬南芥進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化,得到了轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株。4.對(duì)T1代轉(zhuǎn)基因煙草進(jìn)行自然脫水干旱處理,觀察表型變化特,采用15%聚乙二醇(PEG)溶液對(duì)T1代煙草進(jìn)行模擬干旱處理,分析其生理特性。表型變化結(jié)果顯示,干旱處理后野生煙草萎蔫程度比轉(zhuǎn)基因煙草嚴(yán)重,初步說明轉(zhuǎn)基因煙草比野生煙草具有更強(qiáng)的抗旱能力。生理特性分析結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)基因株系的相對(duì)含水量(RWC)、脯氨酸(Pro)含量、可溶性糖含量及超氧化物岐化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)三種抗氧化酶活性均高于野生株系,而相對(duì)電導(dǎo)率、丙二醛(MDA)含量、過氧化氫(H2O2)含量低于野生株系,進(jìn)一步表明了轉(zhuǎn)基因煙草具有更強(qiáng)的抗旱性。5.對(duì)T2代轉(zhuǎn)基因擬南芥進(jìn)行干旱復(fù)水處理,觀察表型變化特征并進(jìn)行生理特性分析。表型變化顯示,干旱處理后轉(zhuǎn)基因擬南芥與野生擬南芥同時(shí)萎蔫,而復(fù)水后只有轉(zhuǎn)基因株系恢復(fù)正常,初步說明轉(zhuǎn)基因擬南芥比野生擬南芥具有更強(qiáng)的抗旱能力。生理特性分析顯示,轉(zhuǎn)基因株系的RWC、Pro含量、可溶性糖含量及SOD、POD、CAT活性均高于野生株系,而相對(duì)電導(dǎo)率、MDA含量、H2O2含量低于野生株系,進(jìn)一步表明了轉(zhuǎn)基因擬南芥具有更強(qiáng)的抗旱性。
【關(guān)鍵詞】：玉米 轉(zhuǎn)錄因子 基因克隆 載體構(gòu)建 遺傳轉(zhuǎn)化
【學(xué)位授予單位】：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S513
【目錄】：

• 摘要2-4
• SUMMARY4-7
• 縮略詞表7-11
• Ⅰ 文獻(xiàn)綜述11-28
• 1 轉(zhuǎn)錄因子概述12-18
• 1.1 轉(zhuǎn)錄因子的概念12
• 1.2 轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)與功能12-14
• 1.3 轉(zhuǎn)錄因子的分類14-15
• 1.4 轉(zhuǎn)錄因子的活性15-17
• 1.5 轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控17-18
• 2 植物AP2/EREBP類轉(zhuǎn)錄因子家族18-22
• 2.1 AP2/EREBP類轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)特征19
• 2.2 AP2/EREBP轉(zhuǎn)錄因子家族的起源和進(jìn)化19-20
• 2.3 AP2/EREBP家族轉(zhuǎn)錄因子的分類20-21
• 2.4 AP2/EREBP轉(zhuǎn)錄因子的功能21-22
• 3 玉米AP2/EREBP類轉(zhuǎn)錄因子研究進(jìn)展22-26
• 3.1 玉米轉(zhuǎn)錄因子家族22-23
• 3.2 玉米AP2/EREBP轉(zhuǎn)錄因子23-25
• 3.3 玉米AP2/EREBP轉(zhuǎn)錄因子家族的抗逆性研究25-26
• 4 本研究目的及意義26-27
• 5 技術(shù)路線27-28
• Ⅱ 材料與方法28-51
• 1 材料28-31
• 1.1 植物材料28
• 1.2 菌種和質(zhì)粒28
• 1.3 化學(xué)試劑、酶制劑及試劑盒28-29
• 1.4 主要儀器設(shè)備29
• 1.5 實(shí)驗(yàn)所需培養(yǎng)基29-31
• 1.6 抗生素及生長(zhǎng)素31
• 2 方法31-51
• 2.1 玉米Zm EREB87目的基因的克隆及生物信息學(xué)分析31-36
• 2.2 玉米中Zm EREB87基因的誘導(dǎo)表達(dá)分析36-38
• 2.3 植物表達(dá)載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化38-43
• 2.4 Zm EREB87轉(zhuǎn)錄因子基因的遺傳轉(zhuǎn)化43-48
• 2.5 轉(zhuǎn)基因植株的抗旱性鑒定48-50
• 2.6 數(shù)據(jù)處理50-51
• Ⅲ 結(jié)果與分析51-82
• 1 克隆及生物信息學(xué)分析51-61
• 1.1 玉米Zm EREB87目的基因的克隆51-54
• 1.2 玉米Zm EREB87基因的生物信息學(xué)分析54-61
• 2 不同非生物脅迫下玉米ZMEREB87基因的表達(dá)模式61-64
• 2.1 玉米Zm EREB87基因的組織特性表達(dá)61-62
• 2.2 不同非生物脅迫Zm EREB87基因表達(dá)的影響62-64
• 3 PCAMBIA3300-35S-EREB87-NOS植物表達(dá)載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)化64-70
• 3.1 自連載體p CAMBIA3300-K的制備64-65
• 3.2 中間載體p CAMBIA3300-K-EREB87的構(gòu)建65-66
• 3.3 表達(dá)載體p CAMBIA3300-35S-EREB87-NOS的構(gòu)建66-69
• 3.4 植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化及鑒定69-70
• 4 玉米ZMEREB87基因?qū)煵菁皵M南芥的轉(zhuǎn)化70-73
• 4.1 玉米Zm EREB87基因轉(zhuǎn)化煙草70-72
• 4.2 玉米Zm EREB87基因轉(zhuǎn)化擬南芥72-73
• 5 轉(zhuǎn)基因植株的抗旱鑒定73-82
• 5.1 轉(zhuǎn)基因煙草的抗旱鑒定73-78
• 5.2 轉(zhuǎn)基因擬南芥的抗旱鑒定78-82
• Ⅳ 討論82-86
• 1 玉米ZMEREB87基因的克隆及生物信息學(xué)分析82-83
• 2 玉米ZMEREB87基因的誘導(dǎo)表達(dá)83
• 3 ZMEREB87基因的植物表達(dá)載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)化83-84
• 4 轉(zhuǎn)ZMEREB87基因植株的抗旱性研究84-86
• Ⅴ 結(jié)論86-88
• 參考文獻(xiàn)88-92
• 致謝92-93
• 作者簡(jiǎn)介93-94
• 導(dǎo)師簡(jiǎn)介94-95

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本文編號(hào)：376463