長角血蜱(Haemaphysalis longicornis)是專性吸血的體外寄生蟲,在自然界中存在兩性生殖種群與孤雌生殖種群,可攜帶多種病原體而導致疾病,給人類健康和畜牧業(yè)生產(chǎn)帶來極大危害。防御素(defensin)是一種抗微生物肽,在動植物中廣泛存在,尤其在節(jié)肢動物中,由于缺乏適應性免疫反應,防御素在其先天免疫防御過程中發(fā)揮重要作用,可以有效對抗入侵的病原體。蜱作為專性吸血的特殊類群,同樣具有防御素家族多肽以抵御微生物或病原體的侵襲。本研究以長角血蜱孤雌生殖種群為研究對象,利用Clontech建庫試劑盒和3’RACE的方法構建cDNA文庫,分子克隆得到三條防御素基因,分別命名為Hp-defensin-1、Hp-defensin-2和Hp-defensin-3。開放閱讀框大小分別為225bp、210bp和237bp,編碼氨基酸個數(shù)為74、69和78,成熟肽長度分別為38、37和46,等電點分別為9.69、8.33和9.50。通過對Hp-defensin-1進行原核表達及功能分析,結果表明,長角血蜱Hp-defensin-1與邊緣革蜱(ACJ04433.1)同源性最高,為75.68%。...

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【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
第一章 文獻綜述
    1.1 引言
    1.2 孤雌生殖種群簡介
    1.3 抗菌肽簡介
    1.4 昆蟲抗菌肽簡介
    1.5 展望
第二章 長角血蜱孤雌種群防御素基因的分子克隆
    2.1 實驗材料
        2.1.1 實驗動物
        2.1.2 實驗試劑及耗材
        2.1.3 實驗儀器
    2.2 實驗方法
        2.2.1 長角血蜱孤雌生殖種群總RNA的提取
        2.2.2 cDNA文庫的構建
            2.2.2.1 建庫試劑盒構建
            2.2.2.2 3’RACE反轉獲得cDNA
        2.2.3 抗菌肽基因的克隆
        2.2.4 抗菌肽基因的全長的擴增
    2.3 實驗結果
        2.3.1 長角血蜱孤雌生殖種群總RNA的提取
        2.3.2 cDNA文庫的構建
        2.3.3 抗菌肽基因的克隆
        2.3.4 抗菌肽基因的生物信息學分析
            2.3.4.1 基因序列分析
            2.3.4.2 Hp-defensin13 的系統(tǒng)發(fā)育樹分析
            2.3.4.3 蛋白序列分析
    2.4 討論
        2.4.1 抗菌肽基因的克隆
        2.4.2 抗菌肽的生物學分析
第三章 長角血蜱孤雌種群防御素基因的原核表達
    3.1 實驗材料
        3.1.1 實驗試劑及耗材
        3.1.2 實驗儀器
    3.2 實驗方法
        3.2.1 構建Defensin基因的原核表達載體
        3.2.2 重組質粒pET-32(a＋)- defensin的誘導表達
        3.2.3 重組蛋白的質譜鑒定
        3.2.4 重組蛋白誘導表達的條件優(yōu)化
        3.2.5 重組蛋白的純化
            3.2.5.1 重組蛋白的大量收集
            3.2.5.2 裝柱準備
            3.2.5.3 蛋白上清的親和層析
    3.3 實驗結果
        3.3.1 構建Defensin基因的原核表達載體
        3.3.2 重組質粒pET-32(a＋)- defensin的誘導表達
        3.3.3 重組蛋白誘導表達的條件優(yōu)化
        3.3.4 重組蛋白的純化
    3.4 討論
        3.4.1 原核表達載體的選擇與構建
        3.4.2 蛋白誘導表達條件的優(yōu)化與純化
第四章 長角血蜱孤雌種群防御素的功能分析
    4.1 實驗材料
        4.1.1 實驗試劑及耗材
        4.1.2 實驗儀器
    4.2 實驗方法
        4.2.1 長角血蜱孤雌生殖種群防御素基因表達量的分析
            4.2.1.1 防御素基因在不同時期不同組織中的表達量
            4.2.1.2 防御素基因不同菌脅迫下的表達量
        4.2.2 抑菌活性的分析
        4.2.3 抗氧化的分析
        4.2.4 溶血活性的分析
    4.3 實驗結果
        4.3.1 長角血蜱孤雌生殖種群防御素基因表達量的分析
        4.3.2 抑菌活性的分析
        4.3.3 抗氧化的分析
        4.3.4 溶血活性的分析
    4.4 討論
        4.4.1 防御素基因的定量分析
        4.4.2 HP-defensin-1 重組蛋白的功能分析
參考文獻
致謝
攻讀學位期間取得的科研成果清單



本文編號：3757578