長(zhǎng)角血蜱(Haemaphysalis longicornis)是專性吸血的體外寄生蟲,在自然界中存在兩性生殖種群與孤雌生殖種群,可攜帶多種病原體而導(dǎo)致疾病,給人類健康和畜牧業(yè)生產(chǎn)帶來(lái)極大危害。防御素(defensin)是一種抗微生物肽,在動(dòng)植物中廣泛存在,尤其在節(jié)肢動(dòng)物中,由于缺乏適應(yīng)性免疫反應(yīng),防御素在其先天免疫防御過(guò)程中發(fā)揮重要作用,可以有效對(duì)抗入侵的病原體。蜱作為專性吸血的特殊類群,同樣具有防御素家族多肽以抵御微生物或病原體的侵襲。本研究以長(zhǎng)角血蜱孤雌生殖種群為研究對(duì)象,利用Clontech建庫(kù)試劑盒和3’RACE的方法構(gòu)建cDNA文庫(kù),分子克隆得到三條防御素基因,分別命名為Hp-defensin-1、Hp-defensin-2和Hp-defensin-3。開放閱讀框大小分別為225bp、210bp和237bp,編碼氨基酸個(gè)數(shù)為74、69和78,成熟肽長(zhǎng)度分別為38、37和46,等電點(diǎn)分別為9.69、8.33和9.50。通過(guò)對(duì)Hp-defensin-1進(jìn)行原核表達(dá)及功能分析,結(jié)果表明,長(zhǎng)角血蜱Hp-defensin-1與邊緣革蜱(ACJ04433.1)同源性最高,為75.68%。...

【文章頁(yè)數(shù)】：67 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
第一章 文獻(xiàn)綜述
    1.1 引言
    1.2 孤雌生殖種群簡(jiǎn)介
    1.3 抗菌肽簡(jiǎn)介
    1.4 昆蟲抗菌肽簡(jiǎn)介
    1.5 展望
第二章 長(zhǎng)角血蜱孤雌種群防御素基因的分子克隆
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
        2.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑及耗材
        2.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 長(zhǎng)角血蜱孤雌生殖種群總RNA的提取
        2.2.2 cDNA文庫(kù)的構(gòu)建
            2.2.2.1 建庫(kù)試劑盒構(gòu)建
            2.2.2.2 3’RACE反轉(zhuǎn)獲得cDNA
        2.2.3 抗菌肽基因的克隆
        2.2.4 抗菌肽基因的全長(zhǎng)的擴(kuò)增
    2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        2.3.1 長(zhǎng)角血蜱孤雌生殖種群總RNA的提取
        2.3.2 cDNA文庫(kù)的構(gòu)建
        2.3.3 抗菌肽基因的克隆
        2.3.4 抗菌肽基因的生物信息學(xué)分析
            2.3.4.1 基因序列分析
            2.3.4.2 Hp-defensin13 的系統(tǒng)發(fā)育樹分析
            2.3.4.3 蛋白序列分析
    2.4 討論
        2.4.1 抗菌肽基因的克隆
        2.4.2 抗菌肽的生物學(xué)分析
第三章 長(zhǎng)角血蜱孤雌種群防御素基因的原核表達(dá)
    3.1 實(shí)驗(yàn)材料
        3.1.1 實(shí)驗(yàn)試劑及耗材
        3.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器
    3.2 實(shí)驗(yàn)方法
        3.2.1 構(gòu)建Defensin基因的原核表達(dá)載體
        3.2.2 重組質(zhì)粒pET-32(a＋)- defensin的誘導(dǎo)表達(dá)
        3.2.3 重組蛋白的質(zhì)譜鑒定
        3.2.4 重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)的條件優(yōu)化
        3.2.5 重組蛋白的純化
            3.2.5.1 重組蛋白的大量收集
            3.2.5.2 裝柱準(zhǔn)備
            3.2.5.3 蛋白上清的親和層析
    3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        3.3.1 構(gòu)建Defensin基因的原核表達(dá)載體
        3.3.2 重組質(zhì)粒pET-32(a＋)- defensin的誘導(dǎo)表達(dá)
        3.3.3 重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)的條件優(yōu)化
        3.3.4 重組蛋白的純化
    3.4 討論
        3.4.1 原核表達(dá)載體的選擇與構(gòu)建
        3.4.2 蛋白誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化與純化
第四章 長(zhǎng)角血蜱孤雌種群防御素的功能分析
    4.1 實(shí)驗(yàn)材料
        4.1.1 實(shí)驗(yàn)試劑及耗材
        4.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器
    4.2 實(shí)驗(yàn)方法
        4.2.1 長(zhǎng)角血蜱孤雌生殖種群防御素基因表達(dá)量的分析
            4.2.1.1 防御素基因在不同時(shí)期不同組織中的表達(dá)量
            4.2.1.2 防御素基因不同菌脅迫下的表達(dá)量
        4.2.2 抑菌活性的分析
        4.2.3 抗氧化的分析
        4.2.4 溶血活性的分析
    4.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        4.3.1 長(zhǎng)角血蜱孤雌生殖種群防御素基因表達(dá)量的分析
        4.3.2 抑菌活性的分析
        4.3.3 抗氧化的分析
        4.3.4 溶血活性的分析
    4.4 討論
        4.4.1 防御素基因的定量分析
        4.4.2 HP-defensin-1 重組蛋白的功能分析
參考文獻(xiàn)
致謝
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本文編號(hào)：3757578