選取小鼠IL-6基因轉(zhuǎn)錄起始位點上游2 000 bp序列作為啟動子序列,采用在線生物信息學(xué)軟件分析轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點;利用PCR擴增小鼠IL-6基因啟動子及其5’端截短突變體片段,構(gòu)建相應(yīng)的熒光素酶報告基因重組質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染3T3-L1細胞后檢測報告基因活性;采用共轉(zhuǎn)染分析轉(zhuǎn)錄因子KLF7對IL-6基因啟動子活性的影響;利用siRNA技術(shù)探究敲低KLF7對細胞內(nèi)源性IL-6基因表達的影響。生物信息學(xué)分析顯示,小鼠IL-6基因啟動子區(qū)存在5個Sp1/KLFs結(jié)合位點;報告基因分析和定點突變分析發(fā)現(xiàn),KLF7通過IL-6基因啟動子區(qū)-98至-89 bp處(CCCCACCCAC)發(fā)揮調(diào)控IL-6基因啟動子活性的作用;Real-time RT-PCR和Western blot分析顯示,敲低KLF7抑制細胞內(nèi)源性IL-6基因表達。文章首次發(fā)現(xiàn)KLF7直接調(diào)控IL-6基因表達,研究結(jié)果對揭示KLF7在脂肪生成中的作用機制具有重要意義。

【文章頁數(shù)】：11 頁

【文章目錄】：
1 材料與方法
    1.1 材料和試劑
    1.2 IL-6基因啟動子區(qū)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點分析
    1.3 IL-6基因啟動子及其5'端截短突變體報告基因載體構(gòu)建
    1.4 IL-6基因啟動子區(qū)KLF7結(jié)合位點定點突變
    1.5 細胞轉(zhuǎn)染與雙螢光素酶檢測
        1.5.1 IL-6基因啟動子截短突變體報告基因活性檢測
        1.5.2 KLF7過表達對IL-6基因啟動子報告基因載體活性分析
        1.5.3 定點突變對KLF7調(diào)控IL-6啟動子活性的影響
    1.6 KLF7基因si RNA設(shè)計和干擾效率檢測
    1.7 RNA提取、反轉(zhuǎn)錄和q RT-PCR
    1.8 Western blot分析
    1.9 數(shù)據(jù)分析
2 結(jié)果與分析
    2.1 IL-6基因啟動子區(qū)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點分析
    2.2 小鼠IL-6基因啟動子報告基因載體構(gòu)建及活性分析
    2.3 小鼠IL-6基因啟動子區(qū)轉(zhuǎn)錄因子KLF7結(jié)合位點鑒定
    2.4 沉默KLF7對IL-6表達的影響
3 討論與結(jié)論



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