慢病毒介導的RNAi對佐劑性關節(jié)炎大鼠脊髓IL-33基因的沉默效應
本文關鍵詞:慢病毒介導的RNAi對佐劑性關節(jié)炎大鼠脊髓IL-33基因的沉默效應,由筆耕文化傳播整理發(fā)布。
【摘要】:第一章慢病毒介導RNA干擾對體外培養(yǎng)大鼠膠質瘤細胞IL-33基因的沉默效應目的構建IL-33基因RNA干擾慢病毒載體并轉染體外培養(yǎng)的大鼠膠質瘤細胞,觀察其沉默效應。方法1.針對大鼠IL-33基因特異性序列,設計3條IL-33-si RNA序列及1條陰性對照序列,合成包含各正義靶序列的互補DNA鏈,退火形成雙鏈DNA,插入到經HpaⅠ和XhoⅠ剪切的GV118的慢病毒載體種,PCR篩選陽性克隆,DNA測序鑒定。與慢病毒包裝質粒p Helper1.0、p Helper2.0轉染至293T細胞,滴度測定后-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?.慢病毒重組體轉染體外培養(yǎng)的膠質瘤細胞C6,觀察轉染效率。3.倒置熒光顯微鏡下觀察C6細胞的形態(tài)改變,Real-Time PCR檢測慢病毒重組體對C6細胞IL-33m RNA的干擾效率。結果1.測序結果證實合成的寡核苷酸鏈插入正確,重組載體構建成功,測定慢病毒滴度為LV-IL33-RNAi(1)為1×109TU/ml;LV-IL33-RNAi(2)為8×108TU/ml;LV-IL33-RNAi(3)為1×109TU/ml。2.慢病毒重組體能成功轉染至C6細胞,相對于陰性對照組,LVIL-33-RNAi(1),LV-IL-33-RNAi(2),LV-IL-33-RNAi(3)組轉染至C6細胞后,IL-33m RNA表達水明降低,其中LV-IL33-RNAi(2)組敲減率最高達到了66.5%,其差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。結論成功構建了大鼠IL-33基因的RNA干擾慢病毒載體,其可使膠質瘤細胞C6的IL-33基因表達下調。這樣為我們下一步動物體內實驗奠定了基礎。也為神經系統(tǒng)IL-33基因功能研究提供一種有效工具。第二章脊髓IL-33對佐劑性關節(jié)炎大鼠外周炎癥及痛覺過敏的調控目的炎癥組織的傷害性刺激會增加脊髓背角神經元的興奮性即發(fā)生中樞敏化。神經元興奮后產生的信號可返回調控外周炎癥,具體機制尚未明確。最近一些研究表明,脊髓IL-33參與了中樞敏化介導疼痛反應。我們的目的是研究脊髓IL-33是否也參與了大鼠佐劑性關節(jié)炎的外周炎癥反應及相關痛覺過敏。方法1.構建大鼠佐劑性關節(jié)炎模型,左側足底皮下注射弗式完全佐劑(complete Freund’s adjuvant,CFA)100μl,CFA注射后2天,鞘內注射LV-sh RNA-IL-33和陰性對照病毒。于術前1天和術后6h、12h、24h(1天)、2天、3天、4天、7天、10天、14天、21天觀察大鼠行為學變化,記錄機械痛閾和熱痛閾,測量足趾腫脹度。2.使用Western-blot技術評估CFA組大鼠1天、2天、3天、4天、7天、10天、14天、21天脊髓IL-33蛋白的表達改變,檢測CFA+LVIL-33-RNAi組和CFA+LV-IL-33-NC組第14天、第21天脊髓IL-33蛋白表達的改變。取21天各組大鼠左側踝關節(jié),HE染色觀察大鼠關節(jié)病理改變。結果1.相比sham組,CFA大鼠的機械痛閾和熱痛閾明顯下降(P0.01),而足趾腫脹程度明顯增加(P0.01)。2.外周炎癥上調了脊髓IL-33蛋白的表達,LV-IL-33-RNAi組第14天和第21天,脊髓IL-33蛋白水平下調,而LV-IL-33-NC組無下調變化。結論外周炎癥上調了脊髓IL-33蛋白的表達,鞘內注射LV-sh RNA-IL-33能下調IL-33蛋白的表達。因此,抑制脊髓IL-33的表達對外周炎癥性疾病可能是一種潛在的治療方法。
【關鍵詞】:IL-33 慢病毒介導RNA干擾 膠質瘤細胞C6 IL-33 佐劑性關節(jié)炎 脊髓 慢病毒介導RNA干擾
【學位授予單位】:新疆醫(yī)科大學
【學位級別】:碩士
【學位授予年份】:2016
【分類號】:R614
【目錄】:
- 中文摘要5-7
- ABSTRACT7-14
- 中英文縮略詞表14-15
- 前言15-17
- 第一章 慢病毒介導RNA干擾對體外培養(yǎng)大鼠膠質瘤細胞IL-33基因的沉默效應17-40
- 引言17-18
- 1 實驗材料18-20
- 1.1 主要儀器與設備18
- 1.2 主要試劑與耗材18-19
- 1.3 質粒和細胞19-20
- 2 實驗方法20-30
- 2.1 IL-33基因RNA干擾慢病毒載體的構建和鑒定20-26
- 2.1.1 siRNA靶點設計20
- 2.1.2 大鼠IL33siRNA的設計與合成20-21
- 2.1.3 雙鏈DNA制備21
- 2.1.4 雙鏈低聚體與載體的連接21-22
- 2.1.5 轉化22
- 2.1.6 陽性克隆的菌落PCR鑒定22-23
- 2.1.7 陽性質粒抽提23-24
- 2.1.8 IL-33基因shRNA慢病毒載體的包裝24-25
- 2.1.9 慢病毒的收集與濃縮25-26
- 2.1.10 滴度稀釋法測定慢病毒滴度26
- 2.2 重組慢病毒載體對體外培養(yǎng)大鼠膠質瘤細胞IL-33基因的干擾效應26-29
- 2.2.1 重組慢病毒靶細胞轉染26-27
- 2.2.2 R./0-T12.3PCR檢測轉染重組后C6細胞IL-33MRNA表達水平的變化27-29
- 2.3 統(tǒng)計學處理29-30
- 3 實驗結果30-37
- 3.1 菌落PCR鑒定結果(圖 1-3)30-31
- 3.2 構建的RNA干擾重組質粒的測序結果31-32
- 3.3 慢病毒包裝和滴度測定結果32-34
- 3.4 慢病毒介導RNA干擾對C6細胞熒光觀測結果34-35
- 3.5 慢病毒介導RNA干擾對C6細胞IL-332RNA的沉默效應35-37
- 4 討論37-39
- 4.1 RNA1技術應用的特點37
- 4.2 慢病毒介導RNA1的特點37-38
- 4.3 慢病毒載體轉染效率驗證38-39
- 5 結論39-40
- 5.1 成功構建了大鼠IL-33基因RNA干擾慢病毒載體39
- 5.2 體外轉染C6細胞,驗證其干擾效率,并篩選出有效靶點39-40
- 第二章 脊髓IL-33對佐劑性關節(jié)炎大鼠外周炎癥及痛覺過敏的調控40-64
- 引言40-41
- 1 實驗材料41-45
- 1.1 實驗動物41
- 1.2 主要設備和儀器41-42
- 1.3 主要試劑與耗材42-43
- 1.4 主要實驗試劑配制43-45
- 2 實驗方法45-53
- 2.1 動物實驗分組45
- 2.2 鞘內置管45-46
- 2.3 動物模型構建46-47
- 2.4 疼痛相關行為學評估47-48
- 2.4.1 機械痛閾檢測47
- 2.4.2 熱痛閾值檢測47-48
- 2.5 組織取材48
- 2.6 Western blot 檢測脊髓 IL-33 蛋白的表達48-51
- 2.6.1 蛋白提取48-49
- 2.6.2 BCA法測定蛋白濃度49
- 2.6.3 分裝蛋白49
- 2.6.4 凝膠配制49
- 2.6.5 SDS-PAGE凝膠電泳49-50
- 2.6.6 濕法轉膜50
- 2.6.7 封閉50
- 2.6.8 孵育一抗50
- 2.6.9 洗膜50
- 2.6.10 孵育二抗50-51
- 2.6.11 洗膜51
- 2.6.12 ECL發(fā)光51
- 2.7 關節(jié)炎評估51-52
- 2.7.1 足趾、關節(jié)體積測定51
- 2.7.2 關節(jié)病理學組織檢查和評分51-52
- 2.8 統(tǒng)計學處理52-53
- 3 實驗結果53-60
- 3.1 佐劑性關節(jié)炎大鼠模型的建立及評價53-57
- 3.1.1 模型大鼠機械痛閾的變化53-54
- 3.1.2 模型大鼠熱痛閾的變化54
- 3.1.3 模型大鼠足趾、關節(jié)腫脹的變化54-55
- 3.1.4 模型大鼠關節(jié)病理學改變55-56
- 3.1.5 模型大鼠脊髓IL-33蛋白水平表達變化56-57
- 3.2 慢病毒重組體沉默IL-33基因對佐劑性關節(jié)炎大鼠脊髓IL-33蛋白水平的影響57-60
- 4 討論60-63
- 4.1 佐劑性關節(jié)炎大鼠模型的構建60
- 4.2 脊髓IL-33對佐劑性關節(jié)炎大鼠外周炎癥和痛覺過敏的可能影響60-61
- 4.3 中樞對外周炎癥的調控61-63
- 5 結論63-64
- 5.1 成功構建佐劑關節(jié)炎大鼠模型,外周炎癥上調了脊髓IL-33蛋白的表達63
- 5.2 鞘內注射LV-4:RNA-IL-33可以抑制脊髓IL-33蛋白水平的表達,L-33可能參與了外周炎癥的調控63-64
- 全文結論64-65
- 參考文獻65-69
- 綜述69-79
- 參考文獻74-79
- 攻讀碩士學位期間主要成果79-80
- 致謝80-81
- 導師評閱表81
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