本文關(guān)鍵詞：慢病毒介導(dǎo)的RNAi對佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠脊髓IL-33基因的沉默效應(yīng)，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：第一章慢病毒介導(dǎo)RNA干擾對體外培養(yǎng)大鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞IL-33基因的沉默效應(yīng)目的構(gòu)建IL-33基因RNA干擾慢病毒載體并轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的大鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞,觀察其沉默效應(yīng)。方法1.針對大鼠IL-33基因特異性序列,設(shè)計(jì)3條IL-33-si RNA序列及1條陰性對照序列,合成包含各正義靶序列的互補(bǔ)DNA鏈,退火形成雙鏈DNA,插入到經(jīng)HpaⅠ和XhoⅠ剪切的GV118的慢病毒載體種,PCR篩選陽性克隆,DNA測序鑒定。與慢病毒包裝質(zhì)粒p Helper1.0、p Helper2.0轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞,滴度測定后-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?.慢病毒重組體轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的膠質(zhì)瘤細(xì)胞C6,觀察轉(zhuǎn)染效率。3.倒置熒光顯微鏡下觀察C6細(xì)胞的形態(tài)改變,Real-Time PCR檢測慢病毒重組體對C6細(xì)胞IL-33m RNA的干擾效率。結(jié)果1.測序結(jié)果證實(shí)合成的寡核苷酸鏈插入正確,重組載體構(gòu)建成功,測定慢病毒滴度為LV-IL33-RNAi(1)為1×109TU/ml;LV-IL33-RNAi(2)為8×108TU/ml;LV-IL33-RNAi(3)為1×109TU/ml。2.慢病毒重組體能成功轉(zhuǎn)染至C6細(xì)胞,相對于陰性對照組,LVIL-33-RNAi(1),LV-IL-33-RNAi(2),LV-IL-33-RNAi(3)組轉(zhuǎn)染至C6細(xì)胞后,IL-33m RNA表達(dá)水明降低,其中LV-IL33-RNAi(2)組敲減率最高達(dá)到了66.5%,其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論成功構(gòu)建了大鼠IL-33基因的RNA干擾慢病毒載體,其可使膠質(zhì)瘤細(xì)胞C6的IL-33基因表達(dá)下調(diào)。這樣為我們下一步動物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。也為神經(jīng)系統(tǒng)IL-33基因功能研究提供一種有效工具。第二章脊髓IL-33對佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠外周炎癥及痛覺過敏的調(diào)控目的炎癥組織的傷害性刺激會增加脊髓背角神經(jīng)元的興奮性即發(fā)生中樞敏化。神經(jīng)元興奮后產(chǎn)生的信號可返回調(diào)控外周炎癥,具體機(jī)制尚未明確。最近一些研究表明,脊髓IL-33參與了中樞敏化介導(dǎo)疼痛反應(yīng)。我們的目的是研究脊髓IL-33是否也參與了大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎的外周炎癥反應(yīng)及相關(guān)痛覺過敏。方法1.構(gòu)建大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎模型,左側(cè)足底皮下注射弗式完全佐劑(complete Freund’s adjuvant,CFA)100μl,CFA注射后2天,鞘內(nèi)注射LV-sh RNA-IL-33和陰性對照病毒。于術(shù)前1天和術(shù)后6h、12h、24h(1天)、2天、3天、4天、7天、10天、14天、21天觀察大鼠行為學(xué)變化,記錄機(jī)械痛閾和熱痛閾,測量足趾腫脹度。2.使用Western-blot技術(shù)評估CFA組大鼠1天、2天、3天、4天、7天、10天、14天、21天脊髓IL-33蛋白的表達(dá)改變,檢測CFA+LVIL-33-RNAi組和CFA+LV-IL-33-NC組第14天、第21天脊髓IL-33蛋白表達(dá)的改變。取21天各組大鼠左側(cè)踝關(guān)節(jié),HE染色觀察大鼠關(guān)節(jié)病理改變。結(jié)果1.相比sham組,CFA大鼠的機(jī)械痛閾和熱痛閾明顯下降(P0.01),而足趾腫脹程度明顯增加(P0.01)。2.外周炎癥上調(diào)了脊髓IL-33蛋白的表達(dá),LV-IL-33-RNAi組第14天和第21天,脊髓IL-33蛋白水平下調(diào),而LV-IL-33-NC組無下調(diào)變化。結(jié)論外周炎癥上調(diào)了脊髓IL-33蛋白的表達(dá),鞘內(nèi)注射LV-sh RNA-IL-33能下調(diào)IL-33蛋白的表達(dá)。因此,抑制脊髓IL-33的表達(dá)對外周炎癥性疾病可能是一種潛在的治療方法。
【關(guān)鍵詞】：IL-33 慢病毒介導(dǎo)RNA干擾 膠質(zhì)瘤細(xì)胞C6 IL-33 佐劑性關(guān)節(jié)炎 脊髓 慢病毒介導(dǎo)RNA干擾
【學(xué)位授予單位】：新疆醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R614
【目錄】：

• 中文摘要5-7
• ABSTRACT7-14
• 中英文縮略詞表14-15
• 前言15-17
• 第一章 慢病毒介導(dǎo)RNA干擾對體外培養(yǎng)大鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞IL-33基因的沉默效應(yīng)17-40
• 引言17-18
• 1 實(shí)驗(yàn)材料18-20
• 1.1 主要儀器與設(shè)備18
• 1.2 主要試劑與耗材18-19
• 1.3 質(zhì)粒和細(xì)胞19-20
• 2 實(shí)驗(yàn)方法20-30
• 2.1 IL-33基因RNA干擾慢病毒載體的構(gòu)建和鑒定20-26
• 2.1.1 siRNA靶點(diǎn)設(shè)計(jì)20
• 2.1.2 大鼠IL33siRNA的設(shè)計(jì)與合成20-21
• 2.1.3 雙鏈DNA制備21
• 2.1.4 雙鏈低聚體與載體的連接21-22
• 2.1.5 轉(zhuǎn)化22
• 2.1.6 陽性克隆的菌落PCR鑒定22-23
• 2.1.7 陽性質(zhì)粒抽提23-24
• 2.1.8 IL-33基因shRNA慢病毒載體的包裝24-25
• 2.1.9 慢病毒的收集與濃縮25-26
• 2.1.10 滴度稀釋法測定慢病毒滴度26
• 2.2 重組慢病毒載體對體外培養(yǎng)大鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞IL-33基因的干擾效應(yīng)26-29
• 2.2.1 重組慢病毒靶細(xì)胞轉(zhuǎn)染26-27
• 2.2.2 R./0-T12.3PCR檢測轉(zhuǎn)染重組后C6細(xì)胞IL-33MRNA表達(dá)水平的變化27-29
• 2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理29-30
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果30-37
• 3.1 菌落PCR鑒定結(jié)果（圖 1-3）30-31
• 3.2 構(gòu)建的RNA干擾重組質(zhì)粒的測序結(jié)果31-32
• 3.3 慢病毒包裝和滴度測定結(jié)果32-34
• 3.4 慢病毒介導(dǎo)RNA干擾對C6細(xì)胞熒光觀測結(jié)果34-35
• 3.5 慢病毒介導(dǎo)RNA干擾對C6細(xì)胞IL-332RNA的沉默效應(yīng)35-37
• 4 討論37-39
• 4.1 RNA1技術(shù)應(yīng)用的特點(diǎn)37
• 4.2 慢病毒介導(dǎo)RNA1的特點(diǎn)37-38
• 4.3 慢病毒載體轉(zhuǎn)染效率驗(yàn)證38-39
• 5 結(jié)論39-40
• 5.1 成功構(gòu)建了大鼠IL-33基因RNA干擾慢病毒載體39
• 5.2 體外轉(zhuǎn)染C6細(xì)胞，驗(yàn)證其干擾效率，并篩選出有效靶點(diǎn)39-40
• 第二章 脊髓IL-33對佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠外周炎癥及痛覺過敏的調(diào)控40-64
• 引言40-41
• 1 實(shí)驗(yàn)材料41-45
• 1.1 實(shí)驗(yàn)動物41
• 1.2 主要設(shè)備和儀器41-42
• 1.3 主要試劑與耗材42-43
• 1.4 主要實(shí)驗(yàn)試劑配制43-45
• 2 實(shí)驗(yàn)方法45-53
• 2.1 動物實(shí)驗(yàn)分組45
• 2.2 鞘內(nèi)置管45-46
• 2.3 動物模型構(gòu)建46-47
• 2.4 疼痛相關(guān)行為學(xué)評估47-48
• 2.4.1 機(jī)械痛閾檢測47
• 2.4.2 熱痛閾值檢測47-48
• 2.5 組織取材48
• 2.6 Western blot 檢測脊髓 IL-33 蛋白的表達(dá)48-51
• 2.6.1 蛋白提取48-49
• 2.6.2 BCA法測定蛋白濃度49
• 2.6.3 分裝蛋白49
• 2.6.4 凝膠配制49
• 2.6.5 SDS-PAGE凝膠電泳49-50
• 2.6.6 濕法轉(zhuǎn)膜50
• 2.6.7 封閉50
• 2.6.8 孵育一抗50
• 2.6.9 洗膜50
• 2.6.10 孵育二抗50-51
• 2.6.11 洗膜51
• 2.6.12 ECL發(fā)光51
• 2.7 關(guān)節(jié)炎評估51-52
• 2.7.1 足趾、關(guān)節(jié)體積測定51
• 2.7.2 關(guān)節(jié)病理學(xué)組織檢查和評分51-52
• 2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理52-53
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果53-60
• 3.1 佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠模型的建立及評價(jià)53-57
• 3.1.1 模型大鼠機(jī)械痛閾的變化53-54
• 3.1.2 模型大鼠熱痛閾的變化54
• 3.1.3 模型大鼠足趾、關(guān)節(jié)腫脹的變化54-55
• 3.1.4 模型大鼠關(guān)節(jié)病理學(xué)改變55-56
• 3.1.5 模型大鼠脊髓IL-33蛋白水平表達(dá)變化56-57
• 3.2 慢病毒重組體沉默IL-33基因?qū)ψ魟┬躁P(guān)節(jié)炎大鼠脊髓IL-33蛋白水平的影響57-60
• 4 討論60-63
• 4.1 佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠模型的構(gòu)建60
• 4.2 脊髓IL-33對佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠外周炎癥和痛覺過敏的可能影響60-61
• 4.3 中樞對外周炎癥的調(diào)控61-63
• 5 結(jié)論63-64
• 5.1 成功構(gòu)建佐劑關(guān)節(jié)炎大鼠模型，外周炎癥上調(diào)了脊髓IL-33蛋白的表達(dá)63
• 5.2 鞘內(nèi)注射LV-4:RNA-IL-33可以抑制脊髓IL-33蛋白水平的表達(dá)，L-33可能參與了外周炎癥的調(diào)控63-64
• 全文結(jié)論64-65
• 參考文獻(xiàn)65-69
• 綜述69-79
• 參考文獻(xiàn)74-79
• 攻讀碩士學(xué)位期間主要成果79-80
• 致謝80-81
• 導(dǎo)師評閱表81

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